环境微生物监测技术及其质量控制

丁奕铭

摘要：为保证环境微生物监测中结果的准确性和可靠性、提高监测人员的操作水平，提出了环境微生物监测的技术及质控措施，指出了微生物监测中各环节存在的常见问题，有助于保证监测结果的质量，为建立微生物检测质量控制体系提供参考。论述了环境微生物监测全流程中的质控要点和方法，以达到对环境微生物监测过程的全面质量控制的目的。

关键词：环境监：测;微生物检测;质量控制

中图分类号：X835 文献标识码：A 文章编号：1674-9944（2019）14-0155-02

1引言

微生物监测是环境监测中一类比较特殊的项目。由于微生物具有生物性和多样性，其在样品中的浓度会随时间和外部环境的变化而产生较大的差异。其特性导致了其样品有效期短，重复性差，检测要求高，且人员操作水平高低常导致结果的差异性。而国内尚未有系统化的微生物监测技术规范出台，故笔者参考有关标准及文献，论述微生物监测中的采样、仪器、设备、检测方法及培养基等检测全过程中常见的技术要点及质控措施，给各机构建立微生物检测质量控制体系提供参考。

2样品采集前的准备

水质样品采集的容器首选带盖/具塞玻璃瓶，使用前应对其进行灭菌。灭菌可采用干热或湿热两种方式。干热灭菌仪器采用电热干燥箱，灭菌温度要求在160℃以上保持至少2 h，湿热灭菌仪器采用高压灭菌锅，压力及温度条件为121℃，保持30min。灭菌后至使用前应保持瓶盖的密封。从而避免因容器原因造成的样品污染。使用过后的容器，如果样品微生物浓度过大，应进行灭活避免污染环境及危害人员。固体样品如土壤/固废采集的容器首选广口玻璃瓶，使用前亦应进行灭菌，采樣后应用牛皮纸对瓶口进行包裹。

采样器在采集样品前亦应进行消毒灭菌。灭菌方法同样品容器的灭菌方法。不具备整套采集器灭菌的采样器可选用75%乙醇对接触样品部位进行消毒灭菌。消毒灭菌后的采样器应存放于洁净的专用包装中带至采样现场。

3样品的采集与运输

样品采集的时候要注意选择具有代表性的样品。在进行微生物监测的时候要做好微生物采样的规划，选取好点位，保证采集样品的代表性。为了保证样品没有受到外界及人为的污染，在选取样品之后注意避免人体及其他污染源接触，使用已消毒的采样器进行采集。采集到的样品应在低温（O～4℃）避光保存。样品采集至送到实验室分析应不超过12 h。样品在运输过程中应配备车载冰箱，保证运输过程中的样品不发生变异。

4微生物检测方法的选择及质量控制

微生物检测的方法一般有平板计数法、MPN法、滤膜法等。平板计数法适用于水、土壤中细菌或者真菌的菌落总数，或者空气中浮游菌、沉降菌的检验。平板计数操作简便，适用的样品类型多，且易于后期菌落的分离纯化，但检出限较高，对于环境中微生物浓度较低的样品无法检出。MPN法是一种利用统计学原理定量检测微生物浓度的方法，根据采用的介质又可分为纸片法与多管发酵法。纸片法方便快速，但仅适用于水样，且易受样品的pH值和还原性物质干扰，容易出现假阴假阳现象。多管发酵法适用样品类型广，常用于特定种群的微生物如大肠菌群等的检验，特别是低浓度的微生物检测，其检出限比平板计数法低，但对于浓度较高的样品往往需要多倍稀释，故需要根据样品来源先进行经验上的预估，且对阳性反应的管应进行下一步的确认。滤膜法只适用于水中微生物的检测，且要求水中悬浮物等杂质不能太多，故一般用于饮用水、纯化水及对于微生物有严格要求的水质检测，其优点是检出限低，检测的样品量大，结果代表性好。

样品进入微生物实验室应通过传递窗，在传递窗中应紫外消毒30min以上，人流物流要分开。人员进入微生物实验室要严格执行自身净化程序：换鞋、更洁净衣、戴口罩、戴手套、手消毒等;无菌室及室内的仪器、设备、材料、工具使用紫外线照射30min或用75%乙醇溶液消毒。样品拆封开盖前要用酒精棉球对封口周围进行消毒，避免污染。检测用的玻璃仪器如吸管、培养皿应进行灭菌后使用，且吸管在微生物检测过程中不得混淆使用;不同样品，不同稀释液应使用不同的吸管，避免交叉污染。在操作时应避免人及衣服接触到培养基、稀释液及样品。检测过程中应于检验区域放置空白平皿用于检测全过程的空气沉降菌。每次实验完后做好桌面、设备表面、地面的清洁卫生，再用紫外灯照射灭菌30min;工作服、鞋帽、口罩应定期更换灭菌。

每批样品在检验时，应同时做空白对照。空白不得有任何反应，否则，该批次样品测定结果无效，应查明原因后重新测定。定期按照样品同样的检验方法进行阳性及阴性对照菌试验，阳性菌株应呈现阳性反应，阴性菌株应呈现阴性反应，否则，该次样品测定结果无效，应查明原因后重新测定。对于检测结果阳性反应不明显，或者疑似假阳性的、假阴性的样品，应挑取典型菌落或培养液，进行下一步的培养确定。另外，可定期购买检定机构的微生物质控样品进行比对。对于实验室内部质量控制，还可以采用人员比对、不同方法比对的方式验证结果的准确性。

5微生物实验室的洁净度控制

实验室的布局与设计应充分考虑到良好的微生物实验室操作和实验室安全的要求。实验室布局设计的基本原则是既要最大可能防止微生物的污染，又要防止检验过程对环境和人员造成危害。一般对于环境微生物的检测，其检测室操作台洁净度应该达到100级（即ISO 5级），背景洁净度应该达到1000级（即ISO7级）的要求。在使用前应至少采用紫外消毒30min以上;使用后应对操作台及相关洁净区域进行清洁并消毒。使用的消毒剂可采用75%乙醇，新洁尔灭溶液，84消毒液;并每月轮换使用，避免微生物出现耐药性而灭菌效力下降。

日常工作中应对微生物实验室的环境进行监测，确保微生物实验室的环境洁净度能达到要求，保证微生物检验结果的可靠性。监测指标有悬浮粒子、沉降菌、高效过滤器完整性测试、风速及换气次数等。监测方法可参照GB/T 25915.1-2010、GB/T 25915.3-2010、GB/T16292-2010、GB/T16293-2010、GB/T 16294-2010中的方法进行监测。

6培养基的质量控制

为确保所用培养基质量符合相关检查的需要，应对培养基的质量进行质量控制实验。对每批购进的或自制的培养基，应进行培养基适用性检查。适用性检查方法一般为使用检定机构制备的对照培养基，使用100cfu/mL左右的适宜标准菌液，用对照培养基和配制的培养基分别培养计数，培养结果配制的培养基与对照培养基的比值应在0.5～2.0的范围内，否则视为不合格。配制好的培养基应保存于O～5℃的冰箱中，其保存期限可通过稳定性试验确定。

7结语

环境监测是环境保护的重要组成部分，它既为了解、评价环境质量状况提供信息，也为制定各项管理制度、法律法规提供科学依据。加强环境监测中的质量控制，保证环境监测数据的准确性与可靠性，是一项至关重要的工作。