不同比例n-6和n-3多不饱和脂肪酸调控NT-proBNP和hFABP保护急性心肌梗死后的心肌损伤

吕珩　鲍丽刚

[摘要] 目的 探讨不同比例的n-6和n-3多不饱和脂肪酸对急性心肌梗死大鼠心肌细胞的保护作用。 方法 采用连续注射异丙基肾上腺素的方法构建急性心梗大鼠模型。通过酶联免疫法检测大鼠血清中NT-proBNP、hFABP和cTnI的水平;TTC和TUNEL染色评估心肌梗死面积和心肌细胞凋亡程度。Western blot和QPCR检测心梗标记基因和凋亡因子的表达。通过向心脏注射干扰NT-proBNP、hFABP、cTnI的慢病毒，進一步检测AMI心肌细胞的凋亡情况。 结果 日粮中添加n-6/n-3多不饱和脂肪酸比例1∶5和1∶10导致AMI大鼠在心梗发生后0、4、8和12 h的NT-proBNP、hFABP和cTnI水平、心梗面积和心肌细胞凋亡均明显低于基础日粮饲喂的AMI大鼠;且1∶10比例的n-6/n-3多不饱和脂肪酸抑制效果最为明显。干扰AMI大鼠心肌NT-proBNP和hFABP导致cTnI、Bax表达降低，Bcl-2表达升高。 结论 日粮添加1∶10比例的n-6/n-3多不饱和脂肪酸能有效缓解急性心肌梗死的发生，且NT-proBNP和hFABP的表达水平是参与心梗后心肌细胞凋亡的重要因子。

[关键词] n-6多不饱和脂肪酸;n-3多不饱和脂肪酸;急性心肌梗死;细胞凋亡

[中图分类号] R542.22          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2019）25-0042-06

Different ratios of n-6 and n-3 polyunsaturated fatty acids regulating NT-proBNP and hFABP to protect myocardial injury after acute myocardial infarction

LV Heng   BAO Ligang

Department of Cardiology， Zhejiang Provincal Tongde Hospital， Hangzhou   310000， China

[Abstract] Objective To investigate the protective effects of different proportions of n-6 and n-3 polyunsaturated fatty acids on cardiomyocytes in rats with acute myocardial infarction. Methods Acute myocardial infarction rat modelswere constructed by continuous injection of isoproterenol. The levels of NT-proBNP， hFABP and cTnI in rat serum were detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）. The myocardial infarct size and cardiomyocyte apoptosis were assessed by TTC and TUNEL staining. Western blot and QPCR were used to detect the expression of myocardial infarction marker gene and apoptotic factor. Apoptosis of AMI cardiomyocytes was further detected by injecting a lentivirus that interferes with NT-proBNP， hFABP， and cTnI into the heart. Results When dietary supplementation of n-6/n-3 polyunsaturated fatty acids was 1：5 and 1：10， the NT-proBNP， hFABP， cTnI levels， infarction size， and myocardial apoptosis were significantly lower than those of basal diet-fed AMI rats at 0， 4， 8 and 12 h after myocardial infarction， and the 1：10 ratio of n-6/n-3 polyunsaturated fatty acids was the most effective. Interfering with myocardial NT-proBNP and hFABP in AMI rats resulted in decreased expression of cTnI and Bax， and increased expression of Bcl-2. Conclusion Dietary supplementation of 1：10 ratio of n-6/n-3 polyunsaturated fatty acids can effectively alleviate the occurrence of acute myocardial infarction， and the expression levels of NT-proBNP and hFABP are important factors involved in cardiomyocyte apoptosis after myocardial infarction.

[Key words] n-6 polyunsaturated fatty acid; n-3 polyunsaturated fatty acid; Acute myocardial infarction; Apoptosis

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死，伴有血清心肌酶活性增高及进行性心电图变化，可并发心律失常、休克或心力衰竭，常可危及生命。尽管早期溶栓、经皮冠状动脉介入治疗和冠状动脉旁路移植术能够降低AMI的死亡率[1，2]，但存活者仍不可避免地经历由氧化应激和心肌细胞凋亡介导的左心室重构[3-7]，因此抑制心肌的氧化应激反应或心肌细胞的凋亡进程对缓解AMI发生后左心室重构和心肌损伤非常重要。

膳食调节是治疗心血管疾病的重要方式之一，临床研究发现膳食中补充n-3多不饱和脂肪酸（n-3 PUFA）对心肌梗死、心律失常等心血管疾病的防治有着显著效果[8-12]。n-3多不饱和脂肪酸作为辅助治疗，在心肌梗死后3个月能够显著降低原发性综合征（死亡、非致命性心肌梗死和非致命性卒中）和次要临床终点（全因死亡率、心脏猝死、心血管死亡）的风险[13]。生物体内的n-3多不饱和脂肪酸（n-3 PUFA）能够与n-6多不饱和脂肪酸（n-6 PUFA）相互作用，并竞争或协同地调节生物学进程。大部分由n-3脂肪酸形成的二十碳烷类化合物具有抗炎症作用，而由n-6脂肪酸衍生的二十碳烷类化合物则能够促炎症反应[14-16]。因此，平衡膳食中n-6/n-3 PUFA的比例对防治心血管疾病中的作用可能比单纯摄入n-3 PUFA更为重要。

本研究发现急性心肌梗死大鼠的膳食中添加比例为1∶5和1∶10的n-6/n-3 PUFA能够显著降低血清中心肌梗死标志物NT-proBNP、hFABP和cTnI的水平，减少梗死面积，并抑制心肌细胞凋亡的发生，且日粮中n-6/n-3 PUFA比例1∶10的效果最为明显，证明膳食中添加1∶10比例n-6/n-3 PUFA对治疗急性心肌梗死和保护心梗后的心肌细胞有着良好效果，这为临床上急性心肌梗死的防治提供一定的理论依据。

1 资料与方法

1.1一般材料

健康成年雄性SD大鼠40只，鼠龄7周左右，体重200～250 g，购自广州赛业生物公司。盐酸异丙基肾上腺素注射液（规格：2 mg/支）和戊巴比妥钠（规格：5 mg/支）购自上海禾丰制药公司。三苯基四氮唑（TTC）购自美国Sigma公司。兔抗大鼠NT-proBNP、hFABP、cTnI、Bcl-2、Bax和GAPDH抗体购自proteintech公司，RIPA蛋白裂解液购自上海碧云天公司，ECL显色液购自Thermo公司，RNA提取试剂盒和逆转录cDNA试剂盒购自promega公司，干扰NT-proBNP、hFABP、cTnI的慢病毒载体及其阴性对照购自上海吉玛公司，细胞凋亡检测试剂盒够自Roche公司，酶联免疫试剂盒购自日本Hitachi公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组与处理  将40只大鼠随机分为四组，每组10只，分别为假手术组（sham）、急性心肌梗死组（AMI）、n-6/n-3比例1∶5的AMI组和n-6/n-3比例1∶10的AMI组。制备模型前，各组大鼠均饲养2周，其中sham组以基础日粮饲喂，AMI组大鼠的日粮中添加不同比例的玉米油、亚麻籽油、橄榄油和黄油，以保证n-6和n-3多不饱和脂肪酸的比例为1∶5和1∶10，四种油的比重见表1。

表1   四种油在混合油中的不同比例（%）

1.2.2 动物模型制备  采用15 mg/kg的盐酸异丙基肾上腺素注射大鼠腹腔，连续注射2 d后制成急性心肌梗死大鼠模型（AMI），假手术组（sham）注射等量生理盐水。

1.2.3 血流动力学检测  制备成功后采用3%的戊巴比妥钠麻醉sham组和AMI组大鼠，并切开气管，将左心室腔与压力换能器和生物信号采集与处理系统连接，并导入血流动力学检测系统，记录左心室压力（LVP），分别获取左心室收缩压（LVSP）、左心室舒张末压（LVEDP）、颈总动脉收缩压（SBP）和舒张压（DBP）检测结果，同时将LVP电信号同步输入微分器，计算 LVP上升和下降的最大速率（±dp/dtmax）。

1.2.4 酶聯免疫法检测AMI各指标  AMI造模成功后，每隔4 h抽取大鼠静脉血，放置4℃冰箱1 h后，3000 rmp离心3～5 min以分离血清。分离后的血清采用酶联免疫试剂盒检测心梗后的各项指标：N端前脑钠肽（NT-proBNP）、心型脂肪酸结合蛋白（hFABP）和心肌肌钙蛋白（cTnI）的水平。

1.2.5 HE染色  取AMI大鼠心脏组织，经4%多聚甲醛固定24 h、流水冲洗24 h后脱水和切片。采用二甲苯脱蜡，经乙醇梯度水化，采用苏木素染色和0.5%盐酸酒精分色，后经梯度乙醇和二甲苯脱水后封片和镜下观察。

1.2.6 心脏梗死面积检测  用三苯基四氮唑（TTC）染色法测定AMI大鼠的梗死面积。大鼠处死后摘除心脏，并切成1.0 mm的厚截面。将切片与1% TTC在37℃磷酸盐溶液中混合孵育10 min后，用Image-Pro Plus 6.0软件测定梗死组织的面积（TTC阴性染色面积）。

1.2.7 TUNEL染色检测心肌细胞凋亡  取假手术组和AMI组大鼠心肌梗死后12 h的心肌组织，放入4%多聚甲醛固定24 h后制做冰冻切片。检测前，将组织切片置于染色缸中，用二甲苯洗2次，每次5 min。用无水乙醇洗2次，每次3 min。用95%和75%乙醇各洗1次，每次3 min。PBS洗5 min后加入蛋白酶K溶液（20 μg/mL），于室温水解15 min，去除组织蛋白。用蒸馏水洗4次，每次2 min。采用TUNEL法检测心脏组织的细胞凋亡过程，定量结果采用TUNEL阳性心肌细胞核占总细胞核的百分比表示。

1.2.8 实时定量QPCR检测  采用promega公司的RNA小提试剂盒提取各组大鼠心脏组织的总RNA。将提取的总RNA逆转录成cDNA后，荧光定量PCR检测NT-proBNP、hFABP、cTnI、Bcl-2、Bax的表达水平。各检测基因的QPCR引物见表2。QPCR结果采用2-△△Ct法计算相对表达量。

表2   实时定量QPCR引物

1.2.9 Western blot检测  各组大鼠于梗死后的12 h处死，于冰上取出心脏组织约100 mg，加入RIPA蛋白裂解液并研磨至液态，至4℃离心机以12000 rpm离心10 min，吸取上清加入4倍体积的SDS loading buffer，混匀后放入100℃水浴5 min。取30 μg的蛋白裂解液加入8% SDS-PAGE凝胶中分别以60 V和100 V电压进行蛋白浓缩和分离，然后转至PVDF膜，以10%脱脂奶粉室温封闭2 h后，加入抗体，4℃过夜孵育后，ECL发光液显色。

1.2.10 大鼠心脏组织的慢病毒注射  采用1 mL注射器向大鼠心梗组织处分别注射500 μL干扰NT-proBNP、hFABP和cTnI的慢病毒载体，注射3 d后，提取心梗组织的RNA和蛋白，检测NT-proBNP、hFABP、cTnI及凋亡相关因子Bcl-2和Bax的表达水平。

1.3 统计学方法

采用GraphPad Prism 6.05软件统计分析实验数据，单因素方差分析One-Way ANOVA和Student's t检验进行差异比较分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 急性心肌梗死大鼠模型的建立及鉴定

异丙肾上腺素连续注射2 d后，检测AMI组和sham组大鼠得到血流动力学和心梗各项指标的变化。如表3、4所示，AMI大鼠的左心室收缩压（LVSP）、颈总动脉收缩压（SBP）和舒张压（DBP）以及LVP上升和下降最大速率±dp/dtmax较sham组明显降低，左心室舒张末压（LVEDP）和心率则明显升高（P<0.01）;心梗的3项指标NT-proBNP、hFABP和cTnI在AMI大鼠血清中的水平明显高于sham组（P<0.01）;HE染色显示sham组大鼠心肌细胞呈梭形、纤维状、规则排列，而梗死心肌细胞肿胀、排列紊乱，出现断裂，部分断裂心肌细胞间隙见炎症细胞浸润， TTC染色可见红色的正常心肌和呈白色的梗死心肌部位，见封三图1。

表4   急性心肌梗死大鼠血清中各项指标检测（x±s）

注：与假手术组（sham）比较，**P<0.01

2.2 四组大鼠不同比例的n-6和n-3多不饱和脂肪酸对心梗NT-proBNP、hFABP和cTnI水平比较

基于hFABP是心梗的早期标志物，心梗发生的24 h之后会回复至正常水平，而NT-proBNP和cTnI在心梗发生后的0～12 h处于上升阶段且12～24 h能达到高峰[17-20]，因此抽取大鼠心梗后0～12 h的血液检测血清中NT-proBNP、hFABP和cTnI的变化水平，结果发现心梗发生后的0、4、8和12 h，这3项指标在以基础日粮饲喂的AMI大鼠血清中的水平明显高于假手术组（P<0.01），而日粮中添加n-6和n-3多不饱和脂肪酸比例为1∶5和1∶10的AMI大鼠，其NT-proBNP、hFABP和cTnI水平则明显低于AMI组，其中多不饱和脂肪酸添加比例为1∶10的AMI大鼠的这3项指标降低更明显，见表5～7。TTC染色四组大鼠并计算梗死面积，结果显示日粮中添加1∶5和1∶10比例的n-6和n-3多不饱和脂肪酸导致AMI大鼠心肌梗死面积明显小于基础日粮饲喂的AMI大鼠，且添加比例为1∶10的AMI大鼠的梗死面积最小（P<0.01），见表8。

2.3 四组大鼠不同比例的n-6和n-3多不饱和脂肪酸对心梗后心肌细胞凋亡及心肌中NT-proBNP、hFABP和cTnI表达的比较

以上实验数据表明n-6和n-3多不饱和脂肪酸能夠缓解AMI大鼠的心肌梗死症状，为证实其对梗死心肌的保护作用，采用TUNEL染色检测AMI大鼠心肌细胞的凋亡情况。结果显示，心梗发生后以基础日粮饲喂的AMI大鼠心肌细胞的凋亡数目明显高于sham组，而日粮中添加1∶5和1∶10比例的n-6和n-3多不饱和脂肪酸导致AMI大鼠心肌细胞凋亡个数明显少于基础日粮饲喂的AMI大鼠，且添加比例为1∶10的AMI大鼠的细胞凋亡数最少（P<0.01），见封三图2a和表9。Western blot和QPCR实验检测心肌中NT-proBNP、hFABP和cTnI以及凋亡相关因子Bcl-2和Bax的表达，结果显示AMI大鼠心肌组织中NT-proBNP、hFABP、cTnI和Bax的表达水平明显高于假手术组，而Bcl-2的表达则明显低于假手术组（P<0.01），证明心梗导致的NT-proBNP、hFABP、cTnI水平升高伴随着心肌细胞凋亡进程。相比基础日粮饲喂的AMI组大鼠，日粮中添加n-6和n-3多不饱和脂肪酸能够明显降低AMI大鼠的NT-proBNP、hFABP、cTnI、Bax的表达和升高Bcl-2的表达，表明n-6和n-3多不饱和脂肪酸对心肌细胞凋亡的抑制作用;其中，与日粮中n-6和n-3多不饱和脂肪酸添加比例1∶5的AMI大鼠相比，添加比例1∶10导致AMI大鼠心肌组织中NT-proBNP、hFABP、cTnI、Bax的表达降低和Bcl-2表达升高的更为显著，表明日粮中n-3多不饱和脂肪酸的比例增加能够更进一步降低心梗大鼠心肌中NT-proBNP、hFABP、cTnI的表达和抑制心肌凋亡过程，以保护受损的心肌组织，见封三图2b和表10。

2.4 四组大鼠NT-proBNP和hFABP对心肌细胞凋亡的比较

以上实验数据提示心梗大鼠的心肌细胞中NT-proBNP、hFABP和cTnI的表达可能与细胞凋亡进程相关。本实验通过向AMI大鼠心脏组织注射稳定干扰NT-proBNP、hFABP和cTnI的慢病毒载体，并采用Western blot和QPCR技术检测NT-proBNP、hFABP和cTnI的表达对凋亡因子的影响。结果发现，干扰NT-proBNP、hFABP和cTnI均会抑制Bax和提高Bcl-2的表达（P<0.01），表明NT-proBNP、hFABP和cTnI是心肌细胞凋亡的上游调节因子;干扰NT-proBNP、hFABP亦会抑制cTnI的表达（P<0.01），而干扰cTnI则对NT-proBNP和hFABP的表达无影响，表明NT-proBNP、hFABP和cTnI参与心肌梗死引起的细胞凋亡途径，而NT-proBNP、hFABP能够调节cTnI的表达，提示NT-proBNP和hFABP是参与心肌梗死引起的细胞凋亡途径的主要因子。见封三图3及表11。

3 讨论

n-3和n-6多不饱和脂肪酸均与降低心血管疾病风险密切相关，饮食中的n-3多不饱和脂肪酸多来源于鱼类和一些植物，而n-6多不饱和脂肪酸则主要来源于植物油和坚果。研究发现，降低n-6和n-3多不饱和脂肪酸的比例能够减少血清中胆固醇含量，比例低于1：1更有利于心血管疾病患者抗炎、抗氧化应激和增强脂质代谢等[21-24]。本研究通过对急性心肌梗死（AMI）大鼠饲喂不同比例的n-6和n-3多不饱和脂肪酸和检测血清中心梗指标的变化，发现1∶5和1∶10比例的n-6和n-3多不饱和脂肪酸能够有效降低急性心肌梗死（AMI）大鼠血清中NT-proBNP、hFABP、cTnI的水平以及减少心机梗死面积，表明低比例的n-6和n-3多不饱和脂肪具有减轻急性心梗的功效。

心肌细胞凋亡是急性心肌梗死发生早期细胞丢失的主要原因之一，高凤兰[25]发现冠心病心脏性猝死患者的梗死心肌细胞凋亡受到Bcl-2和Bax的共同調节;成伶俐[26]构建家兔急性心肌梗死模型，并发现Bcl-2阳性表达的心肌细胞个数与细胞凋亡个数呈负相关，Bax阳性表达的心肌细胞个数则与细胞凋亡数呈负相关，其机制可能是Bcl-2与Bax结合形成异源二聚体，从而终止凋亡进程。本研究通过TUNEL染色发现AMI大鼠的心肌细胞凋亡指数明显高于sham组，而日粮中添加1∶5和1∶10比例的n-6和n-3多不饱和脂肪酸能够减轻AMI大鼠心肌细胞的凋亡程度，且1：10比例的n-6和n-3多不饱和脂肪酸效果最为明显。进一步通过QPCR和Western blot证实低比例的n-6和n-3多不饱和脂肪酸能够提高凋亡抑制因子Bcl-2和抑制凋亡促进因子Bax在AMI大鼠心肌中的表达水平，这些结果表明低比例的n-6和n-3多不饱和脂肪酸能够通过抑制心肌细胞凋亡途径从而减轻AMI大鼠的急性心梗。

研究发现，hFABP是影响胚胎癌细胞凋亡及线粒体损伤的主要因子[27]，cTnI是检测心肌细胞凋亡的特异性标志物[28]，提示hFABP 和cTnI作为心梗标记物不仅能够监测心梗发生，亦是参与细胞凋亡途径的重要因子。Deng J等[29]发现BNP预处理心肌缺血大鼠能够抑制因缺血再灌注导致的心肌细胞凋亡，而与BNP同为心梗标记物的NT-proBNP，其对于急性心肌梗死后细胞凋亡的影响却鲜少报道。本研究发现AMI大鼠血清和心脏组织中NT-proBNP、hFABP、cTnI的水平均明显高于sham组，而n-6和n-3多不饱和脂肪酸在抑制AMI大鼠心肌细胞凋亡同时也降低了NT-proBNP、hFABP、cTnI在心脏中的表达，表明三者的表达水平可能与心肌细胞凋亡的发生密切相关。为此，本研究采用向AMI大鼠心脏组织注射干扰NT-proBNP、hFABP、cTnI的慢病毒载体，并通过QPCR和western blot检测凋亡相关因子的表达，结果发现干扰NT-proBNP、hFABP、cTnI均能导致Bcl-2表达升高和Bax表达降低，而干扰NT-proBNP和hFABP能够抑制cTnI的表达，cTnI的干扰则对NT-proBNP和hFABP的表达水平无明显影响，表明NT-proBNP和hFABP可能作为上游因子参与急性心梗后的心肌细胞凋亡过程。

综上所述，本研究发现日粮中低比例的n-6和n-3多不饱和脂肪酸能够明显降低NT-proBNP、hFABP、cTnI在血清和心脏组织中的水平并抑制心肌细胞凋亡，进而减轻急性心梗后的心肌细胞损伤。

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（收稿日期：2018-09-27）