血小板衍生生长因子受体抑制剂CP-868596对A549细胞毒性的影响及机制

刘冰 杨智承 袁芳

广东药科大学药学院（广州510006）

肺癌类型包括非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）和小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC），其中NSCLC 占80% ～85%［1］。针对NSCLC，由于肺癌患者遗传背景的复杂性，以及现有靶向药物耐药等问题，导致目前治疗效果仍然不佳［2］。血小板衍生生长因子受体（platelet-derived growth factor receptor，PDGFR）在大多数细胞中均有表达，特别是在间质细胞高度表达和活跃，如成纤维细胞和平滑肌细胞。PDGF/PDGFR 信号通路可调控肿瘤细胞的增殖、分化和迁移，然而其抑制剂的抗NSCLC 作用研究仍然匮乏［3］。本研究在非小细胞肺癌A549 细胞上，探讨PDGFR 抑制剂CP-868596 的细胞毒性作用及其分子机制，以期为其临床使用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料实验中所用的培养基和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）均购自Gibco 公司；CP-868596购自selleck 公司；细胞转染试剂Lipofectamine 2000 购Invitrogen 公司；兔抗人Nrf2 一抗、磷酸化Akt 一抗、内参β-tubulin 购自Abcam 公司以及羊抗兔二抗购自Proteintech 公司；DCFH-DA、MTT 均购于Sigma 公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 细胞培养A549 细胞和BEAS-2B 细胞购于ATCC 细胞库。将A549 细胞在含有10%胎牛血清的DMEM 培养基中培养，并将BEAS-2B 细胞在含10%胎牛血清的1640 培养基中培养，培养在37 ℃，含5%CO2的细胞培养箱内。

1.3 MTT 实验将对数生长期的细胞接种于96 孔板中，待24 h 贴壁后依次加入浓度梯度为0～200 nmol/L 的CP-868596，持续孵育48 h ，每孔加入MTT 溶液（5 mg/mL）10 μL 继续培养4 h，去上清，每孔加150 μL 的DMSO 溶液，待完全溶解后，于570 nm 处检测OD值。

1.4 细胞凋亡检测各组收取CP-868596 浓度为0、10、20 、40 nmol/L 处理24 h 后的A549 细胞，使用在4 ℃冰箱预冷后的PBS 洗涤，重复2 次，将洗涤后的细胞重悬于250 μL 的结合缓冲液中。在5 mL 的流式管中加入100 μL 的细胞悬液，在管中加入Annexin-V FITC 5 μL，之后避光继续加入20 μg/mL 的碘化丙锭溶液10 μL。混合后，在室温下避光孵育15 min，向管中加PBS 400 μL，并通过流式细胞仪分析。

1.5 Caspase-Glo 3/7（Promega）检测A549 细胞以种于96 孔板中培养箱孵育过夜。用CP-868596预处理48 h 后，加入Caspase-Glo 3/7 试剂，在37 ℃恒温孵育90 min，使用荧光分光光度计测得荧光素酶发光强度。

1.6 免疫荧光法检测ROS 的含量生长融合至

70%左右的96 孔板内的A549 细胞经不同浓度CP-868596 或继续处理24 h 后，加入10 μmol/L DCFH-DA，37 ℃避光孵育30 min。PBS 洗涤细胞2 次，并将样品置于荧光酶标仪下检测荧光强度，488 nm 激发和525 nm 发射。

1.7 免疫印迹将A549 细胞接种于6 孔板中待24 h 后用CP-868596 48 h 后收集细胞，并向每孔中加入100 μL 的蛋白裂解液。BCA 试剂盒用于测定和定量蛋白，并计算总蛋白质的量。然后进行电泳、转膜。用5%脱脂牛奶配置TBST，在室温下封闭1 h，并加入稀释好的Nrf2 一抗（1∶1 000），在4 ℃冰箱内孵育过夜。用TBST 洗膜3 次，每次5 min，加4 mL 稀释的羊抗兔二抗（1∶5 000），室温孵育1 h，TBST 洗膜，方法同上。然后加入化学发光液，在X 线片暗室进行显影及定影操作。

1.8 qRT-PCR 检测Nrf2 mRNA 的表达使用

Trizol 试剂从A459 细胞中提取总RNA，然后合成cDNA。实时定量RT-RCT 使用SYBR Green Realtime PCR Master Mix（TOYOBO，日本，QPK-201）。使用ΔΔCT 法扩增基因，并使用GAPDH 作为内参。用于实时定量PCR 引物见表1。

1.9 ARE-萤光素酶报告基因测定使用双荧光素酶报告基因检测法（Dual-Luciferase Reporter Assay System）检测样品对Nrf2-ARE 信号传导途径活性的影响。将处于对数生长期的A549 细胞接种于24 孔板中待24 h 细胞贴壁后，用Lipofectamine2000 转染含有荧光素酶报告基因的ARE-Luc 和pTK -Renilla 内参质粒，继续培养18 h 后用药物孵育2 h，除去上清液，并将细胞在室温下振荡15 min，通过离心收集上清液，并使用双报告基因检测试剂盒测定双荧光素酶活力。

表1 引物序列表Tab.1 Primers sequences

1.10 统计学方法采用JMP 7.0 统计学软件进行统计分析，计量资料表示为均数±标准差，组间比较行独立样本t检验，多组间均数比较采用方差分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CP-868596 抑制A549 细胞增殖，并诱导细胞凋亡用不同浓度梯度的CP-868596 作用于A549细胞和BEAS2B 细胞48 h，测得CP-868596 抑制A549 的IC50为54.94 nmol/L，抑 制BEAS2B 细胞IC50为166.14 nmol/L（图1A）。图1B 和1C 表明通过流式细胞术和caspase3/7 活性检测法，发现在CP-868596 作用24 h 后，可导致A549 细胞凋亡。

2.2 CP-868596 升高A549 内ROS 的含量CP-868596 可呈剂量依赖性升高A549 细胞内的ROS含量（图2A）。结果表明在给予ROS 清除剂NAC后（25 μmol/L），可逆转CP-868596 对A549 的凋亡诱导作用（图2B、C）。

2.3 CP-868596降低A549细胞中Nrf2的表达与空白对照组比较，用CP-868596 处理的A549 细胞中Nrf2 蛋白表达降低（图3A）。CP-868596 影响A549 细胞Nrf2 的mRNA 水平（图3B）。同样CP-868596 也可抑制A549 细胞中ARE-Luc 的表达（图3C）。此外，CP-868596 减低Nrf2 靶基因HO-1和HQO-1 的mRNA 表达水平（图3D、E）。这些结果表明CP-868596 引起A549 细胞凋亡和ROS 升高是通过抑制Nrf2 而实现的。

2.4 tBHQ（Nrf2 激活剂）可逆转CP-868596 对A549 细胞凋亡和ROS 水平的影响通过ARE 检测，发现tBHQ 呈剂量依赖性增加A549 中Nrf2 的活性（图4A）。tBHQ（20 μmol/L）可逆转CP-868596对A549细胞凋亡和ROS的影响（图4B～4D）。

图1 CP-868596 对A549 细胞增殖及凋亡的影响Fig.1 The effects of CP-868596 on proliferation and apoptosis of A549 cells

图2 CP-868596 升高A549 细胞内ROS 的含量导致细胞凋亡Fig.2 CP-868596 induced A549 cell apoptosis via stimulation of ROS production

2.5 CP-868596 通过PI3K/Akt 通路抑制Nrf2 的表达CP-868596 可抑制A549 细胞中磷酸化Akt的表达水平（图5A）。在LY294002（PI3K/Akt 通路抑制剂）作用A549 细胞后，Nrf2 和p-Akt 的表达减低；然而，在用LY294002 抑制PI3K/Akt 通路基础上加药CP-868596，不能进一步减低Nrf2 和p-Akt的表达水平（图5B）。

3 讨论

PDGF/PDGFR 的过表达或PDGFR 的激活突变导致的异常PDGFR 信号传导已被证实在多种肿瘤的发生中起关键作用［4］。在非小细胞肺癌中，PDGFR 由基质细胞以及一部分癌细胞大量表达［5］。以往的实验室研究和临床试验已经证实CP-868596 对胃肠道间质瘤和人急性髓系白血病有较好的治疗作用［6-7］。本研究中发现，CP-868596可诱导A549 细胞凋亡呈剂量依赖性，此外，对正常肺上皮细胞BEAS2B 毒性较低（IC50值较高），该结果表明PDGFR 抑制剂CP-868596 对NSCLC 细胞有较好的选择性杀伤作用。

图3 CP-868596 抑制A549 细胞中Nrf2 的表达Fig.3 CP-868596 inhibited Nrf2 expression in A549 cells

图4 tBHQ 可逆转CP-868596 对A549 细胞凋亡和ROS 水平的影响Fig.4 CP-868596 inhibited Nrf2 expression through suppression of PI3K/Akt pathway

图5 CP-868596 通过PI3K/Akt 通路抑制Nrf2 的表达Fig.5 CP-868596 inhibited Nrf2 expression through suppression of PI3K/Akt pathway

研究表明ROS 的过量产生介导了许多药物诱导癌细胞凋亡、坏死和自噬等效应［8-9］。因此，本研究首先检测CP-868596 是否可诱导NSCLC 细胞内ROS 生成。结果表明CP-868596 可使A549 细胞内ROS 的含量随着药物浓度的增加而明显升高。此外，使用抗氧化剂NAC 消除ROS 可显著拮抗CP-868596 诱导A549 细胞凋亡的作用。上述结果表明CP-868596 促进A549 细胞中ROS 大量生成，介导了其诱导癌细胞凋亡作用。

图6 本研究机制通路图Fig.6 The mechanical graphic abstract of this study

Nrf2 是细胞中调控抗氧化反应的重要转录因子，可减低细胞内ROS 水平以维持细胞内氧化还原平衡［10］。PDGFRβ属于受体酪氨酸激酶（RTKs）家族成员，RTKs中许多成员，如表皮生长因子受体，通过激活Nrf2 调控癌细胞中ROS 产生［11］。因此，笔者推测抑制PDGFR 可能通过抑制Nrf2 升高细胞内ROS 水平。本研究发现CP-868596 可显著减低Nrf2 的表达（包括mRNA 和蛋白水平），Nrf2 激动剂tBHQ 可逆转CP-868596 对细胞内ROS 的激发作用；进一步研究发现Nrf2 激动剂tBHQ 可拮抗CP-868596 的诱导凋亡效应。上述结果表明CP-868596 通过抑制Nrf2 的转录表达从而上调癌细胞内ROS 水平，从而诱导癌细胞凋亡。

PI3K/Akt信号是公认的PDGFR下游效应子［12］，且有研究表明PI3K/Akt 信号激活可诱导细胞中Nrf2 表达并增强其活性［13-14］。本研究发现CP-868596 抑制A549 细胞中PI3K/Akt 通路活性；PI3K/Akt 通路抑制剂LY294002 可抑制Nrf2 表达，产生类似CP-868596 的作用，此外，当用LY294002 抑制PI3K/Akt 通路后，CP-868596 不再产生额外抑制Nrf2 表达作用。这些结果充分表明了CP-868596通过抑制A549 细胞中PI3K/Akt 通路抑制Nrf2表达。

综上，本研究表明，PDGFR 抑制剂CP-868596可通过抑制A549 细胞中PI3K/Akt/Nrf2 轴，使得抗氧化信号受阻，进而导致ROS 在A549 细胞中大量累积，最终导致细胞凋亡（图6）。因此，CP-868596可能是潜在有效的抗NSCLC 的辅助治疗药物。