质子磁共振波谱测定大鼠椎体脂肪含量的可行性研究

诸静其 华婷 徐子军 唐睿 汤光宇

同济大学附属第十人民医院放射科，上海 200072

骨髓微环境主要由骨髓基质、微血管、成骨细胞、破骨细胞、脂肪细胞、造血细胞及相关细胞因子等组成，骨髓中脂肪细胞的变化与年龄的增长、退行性骨病以及血液疾病等关系密切[1-4]。因此，定量检测骨髓中脂肪含量对于评估骨骼生理和病理动态变化以及疗效随访具有重要临床价值。

质子磁共振波谱(proton magnetic resonance spectroscopy，1H-MRS)是目前被广泛接受的无创量化骨髓脂肪酸的影像学检查方法，人类和动物骨髓包括红骨髓和黄骨髓，骨髓1H-MRS谱线中水峰峰值信号强度主要来源于红骨髓，而脂峰峰值信号强度主要来源于黄骨髓，这是骨髓1H-MRS的成像基础。通过文献检索发现，国内外活体骨髓1H-MRS的研究主要用于人类及大中型动物[5-6]，尚未见该技术用于测定小型动物(如大鼠、小鼠)骨髓脂肪含量的研究报道。

本研究的目的旨在探讨利用临床商用3.0 T磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)扫描仪对大鼠椎体进行骨髓1H-MRS扫描的可行性，为大鼠疾病模型骨髓脂肪研究提供技术支持。

1 材料和方法

1.1 实验动物

随机选取健康清洁级3月龄雌性SD大鼠20只，未曾交配，体质量为250～290 g，由同济大学实验动物科学部提供，所有动物购入后分笼饲养(≤5只/笼)于同济大学附属第十人民医院动物房(室温为20 ℃～25 ℃，湿度60%～80%，环境清洁，通风良好，12 h光和12 h黑暗交替)，自由饮食，适应性饲养1周后15只大鼠进行影像学及病理学检查，另5只大鼠经腹腔注射4%水合氯醛(剂量：10 mL/kg)麻醉后行双侧卵巢切除术制作骨质疏松模型(尸解发现子宫萎缩、变细判为模型制作成功)，术后9周进行影像学及病理学检查，手术完毕后所有大鼠送回动物房自由饮食。本实验获得同济大学附属第十人民医院动物伦理委员会批准，并依据2006年科技部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》对动物进行实验处理。

1.2 腰椎1H-MRI检查

1.2.1扫描设备及线圈：采用德国进口西门子3.0 T MRI扫描仪(Magneton Verio)，梯度场强40 mT/m，磁场切换率200 mT/ms，16通道。小动物线圈采用上海晨光医疗科技股份有限公司生产的配套大鼠线圈(型号：CG-MUC18-H300-AS，4通道，孔径5 cm)。

1.2.2扫描方法：MRI检查前，4%水合氯醛(剂量：10 mL/kg)经腹腔注射麻醉大鼠，将大鼠俯卧位放入线圈，注意线圈应包裹整个腰部，腰5椎体位于表面线圈中心，先行腰椎轴位、冠状位、矢状位TSE序列T2加权成像(T2-weighted imaging, T2WI)常规扫描用于1H-MRS检查感兴趣区(region of interest，ROI)的定位，具体扫描参数：TR 2 500 ms，TE 74 ms，视野(FOV)80 mm×80 mm，层厚1.2 mm，矩阵 256×256，扫描层数11层，扫描时间为114 s。

常规MRI扫描结束后采用多体素点分辨波谱法(point-resolved spectroscopy，PRESS)进行信号采集，ROI根据常规扫描的T2WI图像定位，大小为30 mm×30 mm×30 mm，一小格体素块大小为2.5 mm×2.5 mm×5 mm，放置于腰5椎体松质骨，避开皮质骨和基底血管， 同时通过手动方法在ROI周围放置上下、前后、左右共6个方向的饱和带以消除ROI以外的信号对波谱扫描的干扰，饱和带宽度为55 mm。波谱采集前采用机器自动预扫描程序完成匀场，但不进行水抑制，然后进行不抑水的1H-MRS扫描，具体扫描参数：TR 750 ms，TE 145 ms，均数12，扫描时间 284 s。

如基线明显不稳或者水、脂峰出现切迹、反向倒置、过宽以及无法辨认则认为不合格，需重新进行1H-MRS扫描直至达到合格标准。每个腰5椎体的FF值均测量两次，取平均值。

1.3 腰椎病理检查

1H-MRS检查结束后24 h内腹腔注射过量4%水合氯醛(剂量：20 mL/kg)处死，取出腰5后取椎体中部骨质放入10%甲醛固定24 h，将固定后的骨组织放入4% EDTA脱钙2周后常规脱水、石蜡包埋、切片，每个石蜡标本制成4 μm厚切片，进行苏木素-伊红(hematoxylin and eosin，HE)染色，光镜下大致观察脂肪细胞的数量和分布。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 腰5椎体1H-MRS分析

15只正常大鼠腰5椎体1H-MRS显示水峰明显高于饱和脂肪酸主峰(长链亚甲基质子)，而不饱和脂肪酸峰烯烃质子和亚甲基质子(与烯烃质子相连)未见明确显示(见图1)。两名放射科医师测得的腰5椎体FF值分别为(10.92±3.31)%、(11.10±3.20)%，95%CI分别为(9.09～12.76)%、(9.33～12.87)%，ICC值为0.954，说明测量骨髓FF值结果几乎一致。

图1 正常3月龄雌性大鼠腰5椎体1H-MRS，水峰(4.65 ppm)明显高于饱和脂肪酸主峰(长链亚甲基质子，1.30 ppm)，而不饱和脂肪酸峰烯烃质子(5.3 ppm)和亚甲基质子(与烯烃质子相连)(2.06 ppm)未见明确显示Fig.1 In a healthy rat aged 3 months, 1H-MRS of the L5 vertebral body showed that water peak (4.65 ppm) was significantly higher than the dominant peak of saturated lipid (bulk methylene protons, 1.30 ppm), but the peaks of unsaturated lipids [olefinic protons (5.3 ppm) and methylene protons (2.06 ppm)] were not obvious.

图2 骨质疏松雌性大鼠腰5椎体1H-MRS，水峰(4.65 ppm)明显高于饱和脂肪酸主峰(长链亚甲基质子，1.30 ppm)，但饱和脂肪酸主峰有所升高，不饱和脂肪酸峰烯烃质子(5.3 ppm)和亚甲基质子(与烯烃质子相连)(2.06 ppm)明确显示，信号振幅较小Fig.2 In an OP rat, 1H-MRS of the L5 vertebral body showed that water peak (4.65 ppm) was also significantly higher than the dominant peak of saturated lipid (bulk methylene protons, 1.30 ppm), but the latter was increased, and the peaks of unsaturated lipids [olefinic protons (5.3 ppm) and methylene protons (2.06 ppm)] were obvious, but the amplitudes were weak.

5只骨质疏松大鼠模型术后9周腰5椎体1H-MRS显示水峰明显高于饱和脂肪酸主峰(长链亚甲基质子)，但饱和脂肪酸主峰有所升高，腰5椎体的FF值为(20.13±4.20)%，而且不饱和脂肪酸峰烯烃质子和亚甲基质子(与烯烃质子相连)明确显示，信号振幅较小(见图2)。

2.2 腰5椎体病理观察

15只正常大鼠腰5椎体HE染色显示骨髓内脂肪细胞少见，散在分布，体积较小(见图3)。

5只骨质疏松大鼠模型术后腰5椎体HE染色显示骨髓内脂肪细胞增多，弥漫分布，体积增大(见图4)。

图3 正常3月龄雌性大鼠腰5椎体HE染色显示骨髓内脂肪细胞(箭)少见，散在分布，体积较小(×200)Fig.3 In a healthy rat aged 3 months, HE staining of the L5 vertebral body showed that adipocytes (arrow) were rare, scattered, and small (×200).

图4 骨质疏松雌性大鼠腰5椎体HE染色显示骨髓内脂肪细胞(箭)增多，弥漫分布，体积增大(×200)Fig.4 In a OP rat, HE staining of the L5 vertebral body showed that adipocytes (arrow) were increased, diffuse, and large (×200).

3 讨论

大鼠体型较小，购买、饲养成本低，对各种造模方法耐受性较好，是比较理想的用于制作各种骨髓疾病模型的小动物。正常大鼠3个月时性腺和内分泌系统发育成熟，肌肉、骨骼基本成型，骨代谢活跃，3～6个月时骨骼增长缓慢，6～12个月时骨密度变化最小。因此，理论上3～6个月龄大鼠骨髓对各种造模方法最敏感，虽然文献报道大鼠骨皮质缺乏Haversian系统且重建率低[8]，但这不会对骨松质中骨髓研究产生影响。

骨髓按其是否具有造血功能分为红骨髓和黄骨髓，人体红骨髓中脂肪组织∶水∶蛋白质约为4∶4∶2，而黄骨髓中脂肪组织∶水∶蛋白质约为8∶1.5∶0.5，骨髓脂肪酸包括饱和脂肪酸(29%～33%)、单不饱和脂肪酸(48%～58%)以及多不饱和脂肪酸(9%～20%)[9]。随着年龄的增长，红骨髓逐渐被黄骨髓取代，红/黄骨髓比例呈下降趋势，导致骨髓内脂肪组织含量逐渐增加，尤其对于老年人群中绝经后妇女，这种趋势更加明显，常常伴随骨质疏松[9-10]。随着研究的进一步深入，学者们还发现不同的脂肪酸成分对骨骼代谢发挥着抗炎和毒性两种截然不同的作用[11-12]。大鼠属于哺乳动物，骨髓脂肪变化特点与人类相似，能很好地模拟人类骨代谢特征。因此，骨髓脂肪酸是评价骨髓疾病非常重要的生物学标志物，临床及动物研究急需影像学检查手段解决活体无创评估骨髓脂肪含量以监测骨髓疾病的发生、发展以及疗效的问题。1H-MRS是一种无创性研究活体器官组织代谢、生化变化及化合物定量分析的一项技术，常用的包括PRESS和激励回波探测法(stimulated-echo acquisition method，STEAM)，PRESS信噪比较高，对运动不太敏感，易于发现长T2的代谢物，而STEAM信噪比较低，对运动较敏感，易于发现短T2的代谢物。1H-MRS的空间定位技术分为单体素和多体素技术，以前者应用最多。目前1H-MRS被广泛接受用于量化骨髓脂肪酸，可以通过测定活体骨髓中水、脂两峰的高度、峰底宽度以及半峰值的宽度等参数对脂肪酸进行半定量分析，常用的指标包括FF、脂水峰比(lipid water ratio，LWR)以及脂水峰线宽(line width，LW)，其中以FF最常用[5-7，13]。

目前国内外利用单体素1H-MRS活体测定人类以及大中型动物骨髓脂肪含量的文献较多，但尚未见利用临床商用MRI仪对大鼠骨髓进行1H-MRS研究的报道，主要原因是大鼠骨骼较小，无法采用单体素1H-MRS检查[14]。通过本研究发现，利用Siemens 3.0 T MRI仪对大鼠进行1H-MRS检查有一定的要求，即体重与骨骼的选择，主要原因是所选骨骼的大小、形状需满足多体素PRESS扫描技术对最小体素块(2.5 mm×2.5 mm×5 mm)的要求，经过多次摸索，本研究最终确定选用体重不低于250 g的3月龄雌性SD大鼠的腰5椎体作为1H-MRS扫描对象，不仅所选大鼠月龄与最早的最佳造模时间(3～6个月)吻合，以此时间点为基线有助于更加全面观察各种模型骨髓脂肪酸含量时序变化规律，而且所选椎体刚好满足多体素PRESS最小体素块对骨骼大小、形状的要求，同时选用5 cm孔径的大鼠专用线圈确保采集图像的质量。本研究测得的正常3月龄雌性大鼠腰5椎体的FF值较低，而骨质疏松大鼠模型腰5椎体的FF值明显增高，且与相应病理观察相符，初步说明了多体素PRESS技术测定大鼠椎体FF值的可行性，同时也为今后相关研究提供FF值参考。而且大鼠全身骨骼仅腰5、腰6椎体符合多体素波谱分析对形状、大小的苛刻要求，但符合条件的体素块在椎体内移动的空间非常有限，因此测得的FF值非常稳定，重复性理想，所获取的1H-MRS图像基线较平稳，水峰与饱和脂肪酸主峰清晰可辨，形态正常，同时还能清晰显示不饱和脂肪酸峰的变化，对今后进行各种动物模型骨髓不同脂肪酸成分的1H-MRS分析提供了坚实的技术支持。

本研究的主要不足是大鼠数量较少以及未将雄性大鼠纳入研究，统计结果可能受上述因素影响。另外，本研究仅观察5只骨质疏松模型大鼠的椎体1H-MRS的波谱特点，目的是与正常大鼠作大致比较，今后有待大样本研究。

总之，本研究显示，临床商用3.0 T MRI扫描仪行1H-MRS检查测定FF值评估大鼠椎体脂肪含量具备可行性，将为今后开展大鼠骨髓脂肪研究提供可靠的无创影像学检测手段。