氨基甲酸酯类农药对蛋白核小球藻联合毒性作用特点及机制

卞志强，张瑾，王滔，徐晨茗，陶梦婷

安徽建筑大学环境与能源工程学院，安徽省水污染控制与废水资源化重点实验室，合肥 230601

氨基甲酸酯类农药是我国广泛使用的农药种类之一[1]，该类农药的分子结构中含有一个N-甲基基团，是一类以甲酸酯为前体化合物发展而来的农药，具有人畜低毒、高效和选择性强等特点[2]，而被广泛应用于农业生产中。正是由于氨基甲酸酯类农药的广泛应用，导致其成为目前水源水中比较常见的有机污染物之一，对环境中生活的生物可能会构成潜在的威胁。有调查研究发现[3]，长江中下游地区作为水稻主产区，广泛使用氨基甲酸酯类和其他类农药防治病虫害，致使这些农药在此处河水中汇集积累。孙英等[4]研究发现，3种氨基甲酸酯类农药(乙霉威、甲萘威和克百威)进入生物有机体后有可能通过形成DNA加合物的形式而进一步导致基因突变，进而对生物体的DNA产生化学损伤。张瑾等[5]研究发现，氨基甲酸酯类农药混合物对淡水生物青海弧菌Q67存在明显的时间依赖毒性，且混合毒性与灭多威的浓度比呈良好的负相关关系。夏更寿[6]研究发现，丁硫克百威、残杀威等6种氨基甲酸酯农药均会对水华鱼腥藻产生不同程度的毒性作用。这些研究说明，氨基甲酸酯类农药对于水生生物具有潜在的风险，已引起人们的高度关注[7]，该类农药污染物也成为GB5749—2006《生活饮用水卫生标准》中非常规指标的检测项目之一[8]。因此，开展氨基甲酸酯类农药对水生生物的安全性研究具有一定的实际环境意义。

藻类在生态系统中起着重要的作用[9]，藻类植物是水生生态系统的初级生产者，能通过光合作用为生物提供足够的氧气和食物，其种类多样性和初级生产量直接影响水生生态系统的结构和功能，对生态系统的平衡和稳定起着重要作用。然而，环境中的污染物能显著影响藻类的生长及分布[10]，如刘永涛等[11]发现渔用药物强力霉素、甲苯咪唑和替米考星对斜生栅藻均具有一定毒性，具有良好的浓度-效应相关性。姜慧等[12]研究发现有机溶剂对蛋白核小球藻具有明显的时间-浓度-毒性效应，陈敏等[13]研究发现抗生素与重金属构成的复合污染物对绿藻也有明显的时间-浓度-毒性效应。徐冬梅等[14]研究发现四环素类抗生素对蛋白核小球藻膜通透性、生长都会产生一定的影响。这些研究均显示环境中的污染物对绿藻具有明显的毒性效应，且绿藻对大部分污染物反应灵敏，同时还与暴露浓度和暴露时间明显相关。

综上所述，本研究拟以5种在素菜、食品和水体等中有残留的氨基甲酸酯类农药包括残杀威(baygon, BAY)、灭多威(methomyl, MET)、抗蚜威(pirimicarb, PIR)、涕灭威(aldicarb, ALD)和呋喃丹(carbofuron, CAR)为研究对象，以蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa, C. pyrenoidosa)为受试生物，应用微板毒性分析法(MTA)[14]测定每种农药及其混合物对蛋白核小球藻的生长抑制作用，同步探讨其对蛋白核小球藻的叶绿素含量、蛋白质含量、超氧化物歧化酶活性(SOD)和脂质过氧化产物丙二醛(MDA)活性的影响，并应用浓度加和(CA)模型分析多元混合物间的毒性相互作用(加和作用、拮抗作用和协同作用)，进一步分析探讨氨基甲酸酯类农药及其混合物对蛋白核小球藻的毒性作用及可能的作用机理，为氨基甲酸酯类农药环境安全性评价提供分析方法和数据参考。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 材料与仪器

实验用蛋白核小球藻(C. pyrenoidosa)购自中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库(FACHB)，编号为FACHB-5，其培养方法参见文献[14]。

5种农药残杀威(BAY)、灭多威(MET)、抗蚜威(PIR)、涕灭威(ALD)和呋喃丹(CAR)的纯度均在99.0%以上，其分子结构、CAS号、分子量和储备液浓度等列于表1中。

表1 5种农药的分子结构、分子量、CAS号、储备液浓度、拟合函数、参数(α、β、a、b、p、q)、部分统计量及半数效应浓度的负对数(pEC50)Table 1 The molecular structure, molecular weight, CAS number, stock concentration, fitted functions, parameters (α, β, a, b, p, q), some statistics and the negative logarithm of the half effect concentration (pEC50) of the five pesticides

注：W为Weibull拟合函数，L为Logit拟合函数，J为Biphasic拟合函数；r为相关系数，RMSE为均方根误差；α和β是拟合函数参数；a和b是低浓度区域中值和斜率，p和q是高浓度区域中值和斜率。

Note: W, L and J are Weibull, Logit and Biphasic fitting function; r and RMSE are correlation coefficient and root-mean square error. α andβare parameters of fitting functions; a and b are the median and slope of the low concentration region; p and q are the median and slope of the high concentration region.

仪器：Synergy 2酶标仪(美国BioTek伯腾仪器有限公司)、SF-CT-1A超净工作台(三发仪器有限公司)、H1650-W医用离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)、DH99-11DN细胞破碎仪(上海狄昊实业发展有限公司)、微量水生植物细胞破碎装置(自制专利)、YXQ-LS-100A立式压力蒸汽灭菌锅(上海博讯医疗生物仪器股份有限公司)、MGC-250光照培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)、Dragon-lab单道可调移液器(10～100 μL，大龙兴创实验仪器有限公司)、PHYTO-PAM浮游植物分类荧光仪(泽泉科技有限公司)和TU—1950双光束紫外可见分光光度计(北京析通用仪器有限责任公司)。

1.2 混合物设计

为了系统研究不同浓度配比的混合物组分间的联合毒性相互作用，采用均匀设计射线法[15-16](uniform design ray, UD-Ray)，设计五元氨基甲酸酯类农药混合体系，包括7条不同浓度配比(pi)的混合物射线R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7(表2)。

1.3 毒性测定

采用微板毒性分析法测定每种农药对蛋白核小球藻在不同暴露时间的浓度-效应数据，其具体实验方法和步骤参见文献[17-18]。

1.4 浓度-效应曲线(CRC)拟合

为了得到单个化合物及其混合物的效应值和效应浓度，尤其是低效应浓度，对MTA法测定的浓度-效应数据进行非线性最小二乘法拟合。一般地，对于呈现经典“S”型特征，采用Logit和Weibull函数拟合[19]，而呈“J”型特征的采用Biphasic函数拟合[20]。非线性函数Logit、Weibull和Biphasic公式如下：

(1)

Logit E=1/(1+exp (-α-β×log10(c)))

(2)

Weibull E=1-exp (exp (α+β×log10(c)))

(3)

式中：E表示效应(0≤E≤1)，c表示单个化合物或者混合物浓度，α和β是参数。a和b是低浓度区域的中值和斜率，p和q是高浓度区域的中值和斜率，m是底部，C是测试化学品的浓度。

无论毒性试验如何精确以及描述函数选择如何准确，固有的实验误差与函数拟合误差均客观存在，在描述拟合函数不确定度的同时也考虑实验误差的置信区间，即观测置信区间(OCI)，常被用于表征毒性实验数据的精密程度。

1.5 混合物毒性相互作用

目前常用CA模型评估混合物毒性作用类型[21]。本研究中应用CA预测各个混合物在相应百分浓度下的混合物毒性并与实验观测毒性进行比较，进而分析各浓度比混合物的毒性作用规律。如果混合物的实验观测毒性偏离CA参考模型预测值则认为该混合物具有毒性相互作用[22]。CA模型的公式表达为：

(4)

或

(5)

式中：ci表示混合物中产生某一效应x%时组分i的浓度，ECx，i表示混合物中第i个化合物单独存在时所产生的效应与混合物总效应x%相同时的浓度，pi表示组分i的浓度分数或者浓度比。

1.6 蛋白核小球藻中叶绿素含量的测定

采用叶绿素荧光仪测定蛋白核小球藻的叶绿素含量。依据时间-浓度-效应曲线，计算每种农药对绿藻的半数效应浓度(EC50)。取适量5种农药储备液于到同等体积的藻液中，使每种农药的浓度为EC50，放入培养箱，其温度、时间与毒性测定温度、时间相同，在不同暴露时间点(24、48、72、96 h)取待测藻液，测其叶绿素含量。

表2 五元混合物体系组分及其浓度配比(pi)Table 2 The concentration ratios (pi) of each substance in five-component mixture system

1.7 蛋白核小球藻中蛋白质浓度的测定

研发者在UNWin软件中增加了DNA/蛋白质测定功能。直接测定蛋白核小球藻的蛋白质含量，在不同暴露时间点(24、48、72、96 h)取待测藻液，置于石英比色皿中，测定蛋白核小球藻的蛋白质浓度。

1.8 蛋白核小球藻中超氧化物歧化酶(SOD)活性和脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量的测定

分别在暴露时间为24、48、72和96 h时，将5种待测藻液分别取2 mL于离心管中，4 ℃水浴条件下超声破碎15 min，4 000 r·min-1离心10 min，取上清液测SOD活性和MDA含量。SOD酶活性测定采用羟胺法测试盒(货号：A001-1)，MDA含量测定采用硫代巴比妥酸(TBA)法测试盒(货号：A003-1)。

2 结果与分析(Results and analysis)

2.1 单一农药对蛋白核小球藻的不同暴露时间-浓度-效应关系

5种氨基甲酸酯农药对蛋白核小球藻的时间-浓度-效应数据的拟合函数、拟合参数值以及统计分析结果(r2和RMSE)见表1。

从表1看出Logit、Weibull和Biphasic函数对暴露72～96 h的浓度-效应数据拟合结果较好(r>0.9, RMSE<0.1)。对于12、24、48 h的数据拟合较差，可能是由于C. pyrenoidosa的生长还处于适应农药存在的阶段，或者需要采用其他更适合的函数拟合。这5种农药的EC50值的范围跨越3个数量级，在不同暴露时间内均为低毒(pEC50<3.5)。不同农药对C. pyrenoidosa的毒性大小不同，且随着暴露时间延长，毒性大小也发生改变。以96 h-pEC50为毒性指标[23-24]，5种农药毒性大小为：呋喃丹(pEC50=3.43)>残杀威(pEC50=2.76)>抗蚜威(pEC50=2.12)>灭多威(pEC50=2.11)>涕灭威(pEC50=1.89)。

以时间为x轴，浓度为y轴，抑制率为z轴构建5种农药的时间-浓度-效应图，如图1所示，残杀威、呋喃丹、灭多威和涕灭威对C. pyrenoidosa的毒性-效应为抑制作用，且随着时间和浓度的增大而增大，呈现经典S形。除呋喃丹，其他3种农药在12 h时几乎无毒性变化，但4种农药的毒性都是随暴露时间延长，毒性逐渐增加，抑制率可达到50%以上。抗蚜威在中低浓度区间对C. pyrenoidosa产生刺激作用，随暴露时间延长刺激作用不断增大，高浓度产生抑制作用，呈现非单调J形浓度-效应特征。

2.2 5种农药对蛋白核小球藻的生理影响

2.2.1 5种农药对蛋白核小球藻中叶绿素含量的影响

植物的光合作用离不开叶绿素，同时叶绿素含量高低能够表征藻细胞的存活状况和生物量的多少[25]。5种氨基甲酸酯类农药在不同时间(24、48、72和96 h)对蛋白核小球藻中叶绿素含量的影响见图2。

从图2可见，5种农药处理的小球藻叶绿素与空白藻液叶绿素含量比较，随暴露时间延长均有减少。但不同农药处理后的藻液中叶绿素变化的规律不同。灭多威的作用下，随着暴露时间的延长，叶绿素减少率不断变小，可能是蛋白核小球藻产生了耐药性。对于其他4种农药，随着暴露时间的延长，叶绿素减少率均不断增大。在96 h时，5种农药处理下，小球藻叶绿素的减少率分别为：呋喃丹(37%)、残杀威(52%)、抗蚜威(44%)、涕灭威(49%)和灭多威(44%)。叶绿素的抑制率在可控误差范围内都接近50%，叶绿素的抑制率与生长抑制率(毒性效应终点)基本相似，可见毒性效应在EC50时大致是受到叶绿素的变化影响。

在不同时间(24、48、72和96 h)时，5种农药处理的小球藻与对照组小球藻相比较，涕灭威、抗蚜威和呋喃丹呈现显著(n=4, P<0.01)统计学差异；残杀威和灭多威呈现显著(n=4, P<0.05)统计学差异，叶绿素含量变化具有时间效应。

2.2.2 5种农药对蛋白核小球藻中蛋白质含量的影响

蛋白质在植物体内承担着重要的功能，蛋白质的含量是细胞活性、生命能力和生活状态的重要指标。5种氨基甲酸酯类农药在不同时间(24、48、72和96 h)对蛋白核小球藻中蛋白质含量影响见图3。

由图3可见，空白组蛋白质含量随暴露时间的延长而增加，所有实验组蛋白质含量均表现随暴露时间的延长而减少。空白组与实验组相比较，存在着实验组高于空白组，表现出刺激作用。呋喃丹、灭多威和涕灭威在24 h时，表现刺激作用，在藻细胞对数生长初期(24 h)，蛋白质含量增加，分别为呋喃丹(-29%)、灭多威(-0%)和涕灭威(-24%)，表现出超补偿作用[26]。抗蚜威和残杀威在整个暴露时间范围内实验组均低于空白对照组，蛋白质含量不断减少。在96 h时5种农药处理下，小球藻蛋白质的减少率分别为：呋喃丹(42%)>残杀威(39%)>抗蚜威(34%)>灭多威(30%)>涕灭威(22%)，其蛋白质减少率排序与生长抑制率(毒性效应终点)排序一致。在72～96 h暴露时间内，空白对照组蛋白质含量与实验组蛋白质含量相比较，5种农药均具有显著性的统计学差异(n=2, P<0.01)，可见蛋白质含量在较长的暴露时间段具有时间效应。

2.2.3 5种农药对蛋白核小球藻中SOD酶活性和MDA含量影响

实验中，我们发现农药处理后的藻液中有无色沉淀，经分析，可能是因为叶绿素和蛋白质的生物合成需要通过一系列的酶促反应，在本实验中绿藻的酶因失去活性而沉淀下来。因此，本实验又进一步分析了酶活性及含量的变化情况。5种氨基甲酸酯类农药和空白样对藻细胞的SOD酶活性和MDA含量的影响见图4。

从图4的SOD活性效应图可看出：涕灭威在24～48 h时SOD活力升高，有效的消除了细胞内自由基的损伤，使细胞代谢缓慢恢复正常。48 h之后的暴露时间，细胞结构损害程度增大，导致酶蛋白的结构受到损害，最终导致其细胞内的SOD含量降低。其他4种农药对藻细胞内的SOD酶活性影响，均随暴露时间的延长而降低，呋喃丹对藻细胞内的SOD活力影响最明显，在暴露时间内不断降低，其他3种农药随暴露时延长SOD活力下降趋势趋于平缓。实验组SOD活性和对照组SOD活性相比较；抗蚜威、残杀威和灭多威在暴露时间24～96 h时均具有显著的统计学差异(n=4, P<0.05)，呈现时间-效应关系。涕灭威在48～96 h时具有显著的统计学差异(n =3, P <0.05)呈现时间-效应关系。短时间内无显著差异。呋喃丹在72～96 h内具有显著的统计学差异(n =2, P <0.01)，呈现时间-效应关系。

图3 5种农药在不同时间对蛋白核小球藻蛋白质含量的影响Fig. 3 Effects of five pesticides on the protein content of Chlorella pyrenoidsa at different times

图4 5种农药在不同时间对蛋白核小球藻超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量的影响Fig. 4 Effects of five pesticides on superoxide dismutase (SOD) activity and malondialdehyde (MDA) content of Chlorella pyrenoidsa at different times

此外，从MDA效应图可以看出，空白藻细胞内的MDA含量随暴露时间的延长缓慢上升。5种农药处理过的藻细胞内的MDA含量随暴露时间的延长均不断上升。侧面反映出氨基甲酸酯类农药对藻细胞内的SOD活性的抑制作用，导致细胞内的膜脂过氧化而产生了毒害的作用[27]。总而言之，藻细的抗氧化能力降低，体内的H2O2积累，藻细胞MDA含量上升，最终导致毒害作用。

2.3 农药五元混合物对蛋白核小球藻的联合毒性作用

2.3.1 农药五元混合物对蛋白小球藻的毒性效应

五元混合物7条射线对蛋白核小球藻的毒性也具有明显的时间依赖性(表2)，其浓度-效应曲线表现出与抗蚜威类似的变化规律，其96 h的浓度-效应曲线见图5。

图5 7条混合物射线在96 h的浓度-效应曲线Fig. 5 Concentration-effect curves of 7 mixture rays at 96 h

从图5可以看出，五元混合物7条射线的96 h浓度-效应曲线呈现“J”型，即低浓度区域毒性作用为刺激作用，高浓度区域产生抑制作用，不同浓度配比射线的毒性-效应存在明显差异，最大刺激作用也不同。结合表2和图5还可以看出，抗蚜威的浓度配比最大，导致五元混合物在低浓度区域产生刺激作用，但是不排除其他物质相互作用也会产生同样的刺激作用，同时也说明多元混合物联合毒性作用的复杂性。

结合表2，我们进一步分析发现，五元混合物的毒性pEC50值与其组分浓度比(pi)具有良好的线性关系(图6)。从图6可以看出，五元混合物的7条射线pEC50与残杀威、灭多威、涕灭威和呋喃丹的组分浓度比(pi)之间有着显著正线性关系，相关系数为0.944、0.811、0.885和0.957，显著性水平为0.001、0.027、0.008和0.001。与抗蚜威的组分浓度比(pi)之间有着显著负线性关系，相关系数为-0.921，显著性水平为0.003。张瑾等[5]研究发现，氨基甲酸酯类农药混合物对淡水生物青海弧菌Q67存在明显的时间依赖毒性，但混合毒性与灭多威的浓度比呈良好的负相关关系，这可能是由于农药对不同生物的毒性作用机理不同。

2.3.2 农药五元混合物对蛋白核小球藻的毒性相互作用

基于CA模型对五元混合物的毒性作用进行评估，混合物对蛋白核小球藻的毒性大部分呈加和作用，少数混合物的CA预测线偏离了混合物毒性的观测值，如图7所示。从图7可以看出，在较高浓度区域，7条射线均呈现出了拮抗作用，但不同的射线，拮抗作用程度不同。在较低浓度区域，7条混合物射线的CA预测线也与观测毒性发生了偏离，但由于CRC曲线呈J形(即刺激作用)，在此浓度区域，可能是混合物的刺激作用使CA预测发生了偏离，但也有可能存在拮抗作用与刺激作用同时发生的复杂情况。对于R6射线，从72 h到96 h，CA预测线偏离观测浓度越来越明显，体现了时间依赖性。结合混合物射线毒性与组分浓度比的相关性，可推断出多元混合物对受试生物的毒性作用，受组分、组分浓度配比和浓度区域等因素的影响。

2.4 5种农药混合物对蛋白核小球藻生理特性的影响

2.4.1 5种农药混合物对蛋白核小球藻中叶绿素含量的影响

选择了五元混合物中具有最大刺激效应的射线R5，测其最大刺激浓度在不同暴露时间(24、48、72和96 h)对蛋白核小球藻叶绿素含量的影响，结果见图8。从图8中可看到，随暴露时间的延长，实验组叶绿素含量均高于空白对照组叶绿素含量。暴露时间在24～48 h时，实验组叶绿素含量增加缓慢，暴露时间在48～96 h时，混合物充分作用于蛋白核小球藻，导致叶绿素含量快速增加，最终叶绿素含量增加近22%。在可控误差范围内叶绿素增加率值与混合物射线R5在96 h时的刺激效应大致接近，可见五元混合物是刺激了叶绿素含量增加从而导致了毒性效应为刺激效应；在不同暴露时间(24、48、72和96 h)实验组小球藻叶绿素含量与对照组小球藻叶绿素含量相比较，在48～96 h时，具有显著的统计学差异(n=3, P<0.05)，呈现时间-效应关系。

图6 五元混合物组分浓度比(pi)与混合物7条射线pEC50线性关系图Fig. 6 The relationship between the concentration ratio of each substance (pi) and the pEC50 value of 7 rays in five-component mixture system

图7 五元混合物在不同暴露时间对蛋白核小球藻的毒性相互作用Fig. 7 Toxicity interaction of five pesticides on Chlorella pyrenoidsa at different times in five-component mixture system

图8 五元混合物对蛋白核小球藻中叶绿素含量的影响Fig. 8 Effects of five-pesticide mixture on chlorophyll content in Chlorella pyrenoidosa

2.4.2 农药五元混合物对蛋白核小球藻中蛋白质含量的影响

五元混合物最大刺激浓度和空白样在不同暴露时间(24、48、72和96 h)对蛋白核小球藻蛋白质含量的影响结果见图9。

图9 五元混合物对蛋白核小球藻中蛋白质含量的影响Fig. 9 Effects of five-pesticide mixture on protein content in Chlorella pyrenoidosa

从图9可看出，随着暴露时间的不断延长，实验组蛋白质含量和对照组蛋白质含量均不断增加，且实验组蛋白质含量在各个暴露时间均高于对照组蛋白质含量，表现出刺激生长作用。在细胞生长初期，刺激作用不明显，随着暴露时间的不断延长，刺激作用增大，蛋白质含量显著增多，增长率达到25%。在暴露时间24～96 h内，实验组蛋白质含量与对照组蛋白质含量相比较，均呈现显著的统计学差异(n=4, P<0.01)，呈现时间-效应关系。

2.4.3 农药五元混合物对蛋白核小球藻中SOD活性和MDA含量的影响

五元混合物最大刺激浓度(混合物射线R5)和空白样在不同暴露时间(24、48、72和96 h)对蛋白核小球藻SOD活性和MDA含量的影响结果见图10。

从图10可以看出，随着暴露时间的延长，空白样藻细胞内的SOD酶活性下降趋势较低，几乎不变，MDA含量稍有增加，此过程为藻细胞正常代谢过程。实验组的藻细胞由于农药混合物的刺激影响，导致SOD活性随暴露时间延长不断增加，且暴露时间越长增加越快。MDA含量随着暴露时间的延长不断降低；在24～96 h暴露时间内，实验组藻细胞SOD活性和空白样藻细胞SOD活性相比较，具有显著的统计学差异(n=4, P<0.05)，呈现时间-效应关系。

图10 五元混合物对蛋白核小球藻中SOD活性和MDA含量的影响Fig. 10 Effects of five pesticide mixture on SOD activity and MDA content in Chlorella pyrenoidosa

综上所述：(1)氨基甲酸酯类农药对蛋白核小球藻毒性均有明显的时间依赖性浓度-效应关系，抗蚜威的CRC呈现J形，其余4种呈S形；不同的农药在同一暴露时间的毒性不同，毒性大小顺序随着时间延长而改变，在96 h的毒性大小顺序为呋喃丹>残杀威>抗蚜威>灭多威>涕灭威。

(2)氨基甲酸酯类农药在较高浓度(如EC50)时，明显降低蛋白核小球中的叶绿素、蛋白质含量以及SOD酶活性，但MDA含量增加，均具有明显的时间依赖性，可能是由于随着暴露时间延长，藻细胞受到破坏，叶绿素也随之遭到破坏，蛋白质含量下降，脂质过氧化的损害大于细胞自身修复能力，导致SOD活性被抑制，细胞的抗氧化能力下降，藻细胞内的H2O2不断积累，导致MDA含量升高。随暴露时间的延长，藻细胞SOD活性变化具有时间-效应关系。

(3)五元混合物体系的毒性具有时间依赖性，7条射线在96 h呈现“低促高抑”现象，且随着浓度配比的不同呈现显著差异。7条射线pEC50与灭多威、残杀威、涕灭威和呋喃丹的组分浓度比(pi)之间有着显著正线性关系，与抗蚜威的组分浓度比(pi)之间有着显著负线性关系；混合物间的拮抗作用不仅与时间有关，还与浓度区域和组分浓度配比(pi)存在明显的关系，这说明抗蚜威的负相关性可能是导致混合物低浓度刺激和高浓度拮抗作用产生的重要因素之一。

(4)五元农药混合物中最大刺激浓度(R5射线)对蛋白核小球藻叶绿素和蛋白质含量以及酶活性均随暴露时间延长逐渐增加，而MDA含量逐渐降低，呈现出与生长抑制毒性一致的变化规律。