畜禽粪污除臭微生物的筛选与鉴定

沈琦，孙筱君，吴逸飞，姚晓红，李园成，孙宏，王新，汤江武*

(1.浙江省农业科学院 植物保护与微生物研究所，浙江 杭州 310021； 2.华中农业大学 生命科学与技术学院，湖北 武汉 430070)

由于畜禽养殖业的规模化发展，畜禽粪污所产生的恶臭、氮磷、添加剂及重金属污染日益严重，已经威胁到农业社会的可持续发展，畜禽粪污已成为我国农业面源污染的主要来源之一[1]，产生的恶臭气体对周围环境及居民的生活造成了严重影响。畜禽粪污产生的恶臭气体主要成分为氨、挥发性含硫化合物、挥发性脂肪酸、吲哚类和酚类[2]，不仅对人类嗅觉产生心理厌恶等不愉快的感觉外，还会对人和动物的呼吸、消化、神经系统等造成不同程度的毒害[3]。因此，进行畜禽粪污的除臭研究变得尤为迫切。

恶臭气体的常见处理方法有物理法、化学法和生物法，其中生物法通过微生物的生理代谢过程来降解恶臭物质，具备投资少、费用低、操作方便且不会造成二次污染等优点[4]，已经成为现阶段畜禽粪污除臭研究的研究热点。研究发现，氨气和硫化氢是最主要的恶臭物质，氨气的挥发量与粪污中其他致臭物质高度相关，减少氨气的挥发可以有效降低粪污恶臭[5]，因而筛选高效的氨气同化微生物及硫化氢同化微生物，进行生物脱臭，可以有效控制畜禽粪污产生的恶臭。本试验从浙江省某养猪场的粪污及周围土壤中分离除臭微生物，以期用于畜禽粪污的除臭，丰富臭气治理的菌种库。

1 材料与方法

1.1 材料

样本采集于浙江省内的3个大型养猪场，样本为不同养猪场中猪的粪便、猪粪周围土壤，各样本采集约50 g。将不同地点采集的同种样本均匀混合后放入冰盒中保存，备用。商品菌剂(LD)购自福建洛东生物技术有限公司。

1.2 培养基

试验用培养基配方如下。YPD培养基：酵母粉5.0 g，蛋白胨10.0 g，葡萄糖20.0 g，加蒸馏水至1 000 mL，pH 7.0；LB培养基：酵母粉5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，加蒸馏水至1 000 mL，pH 7.0；PDA培养基：土豆200.0 g，蔗糖20.0 g，酵母膏2.0 g，磷酸二氢钾2.0 g，硫酸镁1.0 g，加蒸馏水至1 000 mL，pH 7.0；NH3选择性培养基：蔗糖50.0 g，氨水10.0 mL，KH2PO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO40.1 g，1% ZnSO45.0 mL，NaCl 2.0 g，加蒸馏水至1 000 mL，pH 7.0；H2S选择性培养基：葡萄糖5.0 g，K2HPO40.5 g，KNO31.0 g，MgCl20.5 g，NaCl 0.5 g，NH4Cl 0.5 g，Na2CO31.0 g，FeCl20.01 g，加蒸馏水至1 000 mL，pH 7.0；分离纯化培养基：KH2PO42.0 g，NH4Cl 0.4 g，Na2CO30.4 g，MgCl2·6H2O 0.2 g，加蒸馏水至1 000 mL，2%琼脂。

1.3 方法

1.3.1 菌种的富集驯化

各取5 g风干样本分别接入100 mL NH3和H2S选择性培养基，30 ℃、220 r·min-1摇床培养，2 d后更换培养基，吸取10 mL驯化培养液加入100 mL新鲜的选择性培养基中进行第2代驯化，连续富集驯化4次。

1.3.2 菌种的分离纯化

取富集液10 mL于盛有90 mL无菌水的三角瓶中，振荡20 min，静置1 min。用10倍稀释法，将不同梯度的稀释液涂布于氨气和硫化氢的选择性培养基。取0.2 mL菌液分别涂布在不同的固体分离平板培养基上，设置3个重复试验，置于30 ℃恒温培养箱内培养，3～5 d将分离平板中的菌落采用平板划线法进一步纯化，将特征不同的菌落分别接种于相应的斜面培养基上培养后，保存备用，挑取分离后的菌株接种于相应的液体培养基上，30 ℃、220 r·min-1摇床扩大培养3 d。

1.3.3 除臭菌株的初筛

取新鲜的猪粪200 g置于1 000 mL大烧杯中，按照3%的接种量将菌液接种于烧杯中，用玻璃棒将培养液与猪粪混合均匀，密封烧杯，对照组(CK)为等量的无菌水，每组3个重复，30 ℃静止培养7 d，通过感官方法判断微生物的除臭效果。感官法判断标准[6]：0级，未闻到任何气味，无任何反应；1级，勉强闻到气味，但不明显；2级，闻到较弱气味；3级，很容易闻到气味；4级，臭味很大，想离开；5级，臭味极强，立即离开。

1.3.4 除臭菌株的复筛

选择初筛中具有较好除臭效果的菌株进行复筛试验，以5%接种量将菌株接种至相应培养基，培养成菌液。称取500 g新鲜猪粪放入2 L大烧杯中，按照3%接种量接种菌液到烧杯中，用玻璃棒充分混匀，同时以加等量无菌水处理作为空白对照组。在大烧杯中放置2个50 mL小烧杯，一个装有20 mL硼酸吸收液，用于吸收氨气，另一个装有20 mL锌铵络盐溶液，用于吸收硫化氢。大烧杯用双层保鲜膜封口，静置培养，第7天取出吸收液，利用硼酸吸收凯氏定氮法[7]和锌铵络盐比色法[8]分别测定氨气和硫化氢释放量，每组重复试验3次，取出后放置新的吸收液。处理组与空白对照组进行差异显著性分析，计算氨气与硫化氢的降解率，确定臭气降解率较高的除臭菌株。

1.3.5 除臭菌株的鉴定

通过2次筛选试验，对具有明显抑制臭气释放的菌株进行形态观察及分子鉴定。将菌悬液划线到PDA培养基上，30 ℃恒温培养48 h后，进行形态观察。挑取菌落加入装有PCR反应体系的PCR管中，进行16S rRNA基因扩增，然后将目的片段送至上海生工进行测序，所得结果在GeneBank上进行同源性比对分析，所用引物为原核生物16S rRNA PCR通用引物(F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA G-3′；R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.3.6 除臭效果检测

称取1 kg新鲜猪粪置于10 L大桶中，按照1%、3%和5%的接种量接种Z2菌液，上方放置2个100 mL烧杯，分别装有50 mL硼酸吸收液和50 mL锌铵络盐溶液，同时以加等量无菌水作为空白对照组，每组设3个重复。大桶用保鲜膜及塑料膜封口，室温静置培养，第7天和第14天分别测定氨气和硫化氢的释放量，与对照组进行分析，计算菌株对氨气和硫化氢的降解率。

1.3.7 统计学分析

应用SPSS 18.0软件对试验数据进行统计分析，试验数据以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 除臭菌株的初筛

经过氨气和硫化氢选择性培养基的富集驯化后，通过划线法分离菌株，共分离得到12株可以同化氨气或硫化氢的菌株(表1)，分别命名为Z1-Z4、S1-S5、Y3、Y6和GH。对分离得到的各菌株进行初步去除氨气和硫化氢的试验，根据感官筛选法，12株菌株中Z2的除臭能力最强，处理后恶臭强度级别为“0”；S1、Z3、Y3、Y6、GH的除臭能力次之，处理后恶臭强度级别为“1”。选择S1、Z2、Z3、Y3、Y6、GH菌株进行复筛。

表1 除臭菌株的感官评级

2.2 除臭菌株的复筛

对初筛得到的6株除臭菌株进行复筛，计算第7天和第14天各菌株对氨气和硫化氢的降解率，同时与商品菌剂(LD)的除臭效果作比较。

图1结果可以看出，在初筛中表现出较好除臭能力的菌株在复筛实验也有一定的除臭能力。大部分菌株对氨气的降解率要高于对硫化氢的降解率；氨气的降解率随着时间的延长略有提高，硫化氢的降解率随着时间的延长略有下降。菌株Z2、Z3和GH的除臭效果均优于商品化菌剂LD。综合分析菌株对氨气和硫化氢的降解率，菌株Z2的除臭效果最好。

图1 除臭菌株的硫化氢、氨气降解率

2.3 除臭菌种的鉴定

2.3.1 除臭菌株Z2的菌落形态特征

将Z2菌株划线接种于PDA培养基中，30 ℃培养48 h。经恒温培养后，长成0.5～1.0 mm白色菌落，菌落米黄色不透明，圆形低平，边缘整齐，湿润且扁平(图2)。显微镜下观察到菌体呈杆状，形成芽孢(图3)。

2.3.2 Z2菌株的16S rRNA基因序列分析

经16S rRNA基因序列分析，所获得的高效粪污除臭菌株Z2与弯曲芽孢杆菌(Bacillusflexus)的相似性水平达98%，结合细胞、菌落形态试验结果，可基本确定Z2为弯曲芽孢杆菌(Bacillusflexus)。

图2 Z2菌落的形态特征

2.4 不同接种量对Z2菌株除臭效果的影响

如图4所示，氨气的降解率随着时间的延长而提高，第14天时最高；硫化氢的降解率随着时间的延长而下降，在第7天最高。接种量为1%～3%范围内时，菌株对氨气的去除率随着添加量的增大而增大；菌株对硫化氢的降解率与接种量无关。

图4 不同接种量对氨气、硫化氢的降解效果

3 讨论

畜禽养殖场的恶臭主要来源于畜禽粪污。本研究从养殖场的土壤和粪便采样进行除臭微生物筛选，提高了筛选的概率和针对性。通过驯化富集得到了12株可以同化氨气或硫化氢的菌株，经过初筛、复筛，获得6株具备除臭能力的菌株，其中菌株Z2可以同时高效去除氨气和硫化氢。通过对该菌株进行了鉴定，包括形态学观察及16S rRNA基因分析，确定该菌株为弯曲芽孢杆菌(Bacillusflexus)。采用小试试验发现，该菌株对猪粪具有较好的除臭效果，且接种量仅需1%～5%，在畜禽粪污除臭方面具有较好的应用前景。同时可以耐受高温的菌株，在堆肥实践中具有较好的应用价值[9]，菌株Z2由于可以产生芽孢耐受高温，因而其在堆肥中也可以应用。

畜禽粪污产生的臭气成分复杂，单一菌株通常难以实现对多成分臭气的高效去除，因而除臭菌群的筛选往往成为研究热点[10]。本试验得到的菌株Z2对氨气和硫化氢均可以去除，但是小试结果发现，Z2对硫化氢的降解率随着时间的延长有明显的下降。因此，后续研究将筛选可以持续高效去除硫化氢的菌株，并与菌株Z2进行复配制备成高效的除臭菌剂，并对其作用机理进行深入的探讨。