饲用枯草芽孢杆菌JY24发酵条件的优化

孔利华， 高书锋， 雷 平， 曾发姣， 缪 东， 周映华，龚 平， 周小玲，曾 奥， 邬理洋， 舒 燕， 胡 丹， 王升平， 刘惠知

(湖南省微生物研究院， 湖南 长沙 410009)

近年来，畜禽养殖不断向规模化、集约化发展，抗生素在饲料中普遍使用，导致了诸多弊端，破坏畜禽肠道正常菌群平衡，引起内源性及二重感染，严重导致畜禽产品及环境中药物的残留[1-3]。当前，随着饲料中抗生素的全面禁止，迫切需要新的替代品。中药和微生态制剂作为两大类饲料添加剂，具有纯天然、无毒害、无药残、安全方便及功能全面等优点，已成为国内外研究的热点[4-7]。

黄芩具有多种药理活性，包括抗炎[8-9]、抗氧化[10]、抗微生物[11]、抗病毒[12-13]、清除自由基[14]等。其主要成分为黄芩苷，其次为黄芩素、汉黄芩苷和汉黄芩素；黄芩苷不易被动物机体直接吸收，需经肠道菌群作用水解成苷元黄芩素后，才能发挥其药效作用[15]；大量临床药效试验证明，黄芩素的药理作用强于黄芩苷。由于黄芩中游离型苷元(黄芩素)的含量很低(约1%)，主要以结合型的糖苷(黄芩苷)形式存在(含量大于10%)，导致游离型苷元远不能满足市场需求和临床应用。因此，将黄芩苷转化为黄芩素，提高其药理活性具有重大的实际意义。目前，黄芩素大多从药材中直接提取，近年来虽有利用侧耳菌[16]、黑曲霉[16-17]、米曲霉[18]、罗尔夫青霉[19]、纳豆芽孢杆菌[20]及短乳杆菌[21]对黄芩进行生物转化的研究报道，但转化过程中所用菌种多属真菌类，难免会产生安全性问题，而作为益生菌的纳豆芽孢杆菌，却非肠源固有土著菌种，在动物肠道中能否定殖、发挥益生作用还不明确。

JY24菌株是课题组从鸡源肠道内容物中筛选得到的1株产β-葡萄糖醛酸苷酶的枯草芽孢杆菌，其可将黄芩苷转化为黄芩素。JY24菌株产芽孢，能耐受饲料加工过程中的高温，并降低运输保藏过程中的失活现象；对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等肠道致病菌具有抑制作用，有益于降低畜禽腹泻率；同时产淀粉酶、蛋白酶，可起到辅助消化、促进生长的作用；源于肠道，具有天然的耐受胃肠道和定殖优势，经体外模拟试验，对人工胃液、肠液均有较强耐受性。JY24菌株是微生态制剂和中药黄芩发酵转化研发领域内潜在的理想菌株，但还需要对该菌制剂及与黄芩联用对肉仔鸡临床应用效果进行研究，并有必要对该菌株发酵工艺进行研究。鉴于此，采用单因素试验与正交试验相结合的方法对其摇瓶发酵条件和培养基组成进行筛选，并在此基础上优化培养基成分，旨在为JY24菌株的中试生产和产品研发奠定基础。

1材料与方法

1.1供试材料

1.1.1菌种枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)JY24菌株，由湖南省微生物研究院动物营养微生物室从鸡肠道内容物中分离、筛选和保藏。

1.1.2培养基

1) 斜面培养基。蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化钠5 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

2) 种子培养基。蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化钠5 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

3) 基础发酵培养基。葡萄糖10 g，蛋白胨10 g，磷酸二氢钾1.0 g，硫酸镁0.5 g，氯化钠5 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

1.1.3主要设备LRH-400A生化培养箱、ZQZY-AS9恒温培养振荡器、GZX-9146MBE电热恒温干燥箱、BH-2型OLYMPUS显微镜、LS-30高压灭菌锅和PHS-3C型数显酸度计。

1.2方法

1.2.1菌种预处理

1) 菌种活化。将枯草芽孢杆菌JY24菌株活化后转接到斜面培养基，33℃培养24 h备用。

2) 种子液制备。取3环活化斜面菌种接入装有100 mL种子培养基的500 mL三角瓶中，33℃、200 r/min培养18 h备用。

1.2.2枯草芽孢杆菌最佳发酵条件优化试验

1) 转速。试验设4个处理，即摇床转速为150 r/min、180 r/min、210 r/min和240 r/min。按1%的接种量将种龄为18 h的枯草芽孢杆菌种子液转接到装液量为20%、pH 7.0的发酵培养基上，在33℃条件下培养48 h。采用梯度稀释法[22]检测发酵液的活菌数，确定摇床最佳发酵转速。

2) 装液量。试验设5个处理，即发酵培养基装液量为10%、15%、20%、25%和30%。按1%的接种量将种龄为18 h的枯草芽孢杆菌种子液转接到初始pH 7.0的不同装液量发酵培养基上，置33℃、240 r/min摇床发酵48 h，检测发酵液的活菌数，确定最佳装液量。

3) 发酵时间。试验设7个处理，即发酵时间为18 h、24 h、30 h、36 h、42 h、48 h和54 h。按1%的接种量将种龄为18 h的枯草芽孢杆菌种子液转接到装液量为10%、初始pH 7.0的发酵培养基上，置33℃、240 r/min摇床发酵，检测发酵液的活菌数，确定最佳发酵时间。

4) 接种量。试验设5个处理，即接种量分别为1%、3%、5%、7%和10%。将种龄为18 h的枯草芽孢杆菌种子液分别按相应接种量转接到装液量为10%、pH 7.0的发酵培养基上，置33℃、240 r/min摇床发酵36 h，检测发酵液的活菌数，确定最佳接种量。

5) 发酵温度。试验设5个处理，即发酵温度分别为31℃、33℃、35℃、37℃和39℃。以3%的接种量将种龄为18 h的枯草芽孢杆菌种子液接入初始pH 7.0、装液量为10%的发酵培养基，置240 r/min摇床发酵36 h，检测发酵液的活菌数，确定最佳发酵温度。

6) 初始pH。试验设7个处理，即初始pH分别为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0。以3%的接种量将种龄为18 h的枯草芽孢杆菌种子液接入装液量为10%的不同初始pH发酵培养基，置35℃、240 r/min摇床发酵36 h，检测发酵液的活菌数，确定发酵培养基最佳初始pH。

1.2.3枯草芽孢杆菌发酵培养基组分的筛选

1) 碳源。以基础发酵培养基中葡萄糖的碳含量计算碳浓度，将基础发酵培养基中碳源分别用蔗糖、淀粉、红糖、糖蜜和麦麸替换，按1.2.2筛选的最佳发酵条件进行发酵。检测发酵液的活菌数，确定最佳碳源。

2) 氮源。以基础发酵培养基中蛋白胨的氮含量计算氮浓度，将基础发酵培养基中的氮源分别用酵母粉、酵母膏、黄豆粉、牛肉膏、硝酸钾和碳酸铵替换，按1.2.2筛选的最佳发酵条件进行发酵，测定发酵液的活菌数，确定最佳氮源。

3) 磷源。以基础发酵培养基中磷酸盐的磷含量计算磷浓度，将基础发酵培养基中的磷源分别用磷酸二氢钾、1/2磷酸二氢钾+1/2磷酸氢二钾、磷酸氢二钾替换，按1.2.2筛选的最佳发酵条件进行发酵，测定发酵液的活菌数，确定最佳磷源。

4) 无机盐。去掉基础发酵培养基中的无机盐，分别添加0.002 mol/L的硝酸钾、氯化钠、氯化钙、硫酸镁、硫酸锰、三氯化铁、硫酸亚铁和硫酸铜，以不加任何无机盐的发酵培养基为对照(CK)，按1.2.2筛选的最佳发酵条件进行发酵，测定发酵液的活菌数，确定最佳无机盐类。

1.2.4发酵培养基组成的优化根据JY24菌株发酵培养基组分的单因素试验结果，选取最佳碳源、氮源和磷源及2种对发酵水平影响较大的无机盐类，采用5因素4水平的正交试验设计，选用L16(45) 正交表进行正交试验(表1)，对试验结果进行直观分析和方差分析，优化培养基组分。

表1 发酵培养基正交试验因素和水平设计

2结果与分析

2.1枯草芽孢杆菌的发酵条件

从图1看出不同培养条件对枯草芽孢杆菌发酵水平(发酵液活菌数)的影响不同。

2.1.1转速随发酵摇床转速的增大，发酵液活菌数呈增加趋势。转速为240 r/min时，发酵液活菌数最高，为7.5×108CFU/mL；转速为150 r/min时，发酵液活菌数最低，为5.2×108CFU/mL。由于转速越大，发酵液溶氧越高，因此在发酵过程中尽可能提高转速以提高好氧菌的发酵水平。试验初步确定摇床最佳转速为240 r/min。

2.1.2装液量随着装液量的增加，发酵液活菌数逐渐减小。装液量为10%时，发酵液活菌数最高，为9.5×108CFU/mL，装液量为25%和30%时，发酵水平最低，均为4.0×108CFU/mL。摇瓶装液量越少，相对溶氧量越大，好氧菌生长代谢旺盛，有利于发酵水平的提升；但装液量太少，发酵过程中发酵液会有一定蒸发，易造成试验结果偏差。因此，初步确定最佳装液量为10%。

2.1.3发酵时间随发酵时间的延长，发酵水平呈先升后降趋势。其中，发酵时间为36 h时发酵液活菌数最高，为1.2×109CFU/mL。细菌群体的生长规律一般可分为迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期4个时期，稳定期的活菌数量最高并维持稳定；当细菌生长进入稳定期时，即可终止发酵。因此，初步确定最佳发酵时间为36 h。另，接种物种龄处于对数期时，接种后能够迅速繁殖，接种非对数期种龄接种物则延长发酵过程，故在发酵时间优化时，应确保接种物种龄处于对数期。

2.1.4接种量随接种量的增加，发酵液活菌数呈先升后降趋势。其中，接种量为3%时，发酵液活菌数较高，为1.4×109CFU/mL；接种量增加，发酵液活菌数减少，当接种量为7%时，发酵水平最低，发酵液活菌数为2.0×108CFU/mL。接种量对发酵水平的影响相对较大，接种量大可以实现快速启动，但接种量过多易导致菌种吸收不到足够的营养而影响生长繁殖；接种量少则延长发酵周期，增加能耗和杂菌污染机会[23]。接种量过多或过少均不利于菌体生长，因此，初步确定最佳接种量为3%。

2.1.5温度不同温度对枯草芽孢杆菌发酵水平有较大影响，随发酵温度的升高，发酵水平呈先升后降趋势。其中，发酵温度为35℃时，发酵液活菌数最高，为1.5×109CFU/mL；温度继续升高，发酵水平降低；当温度为39℃时发酵水平最低，发酵液活菌数为1.0×108CFU/mL。温度对微生物的影响具体表现为影响酶活性，进而影响细胞物质的合成；影响细胞质膜的流动性，影响物质的运输、吸收和代谢；影响物质的溶解性，同时影响到物质的吸收。微生物无时不在改变生长速率，以适应环境温度的变化，每个菌株都有各自的最低、最适和最高生长温度。因此，初步确定最佳发酵温度为35℃。

2.1.6初始pH不同初始pH对发酵水平影响较大，随pH的升高，发酵水平呈先升后降趋势。其中，pH 7.0时，发酵液活菌数最高，为1.7×109CFU/mL；pH 5.5和pH 8.0时，摇瓶发酵生长均较差，发酵液活菌数分别为0.01×108CFU/mL和0.14×108CFU/mL。不同初始pH的发酵液发酵水平相差较为悬殊，原因在于pH通过影响酶促反应、细胞质膜的透性、膜结构的稳定性和物质的溶解性或电离性等影响物质的吸收，进而影响细菌的生长速率，最终直接影响发酵水平。因此，初步确定最佳初始pH为7.0。

图1不同培养条件枯草芽孢杆菌活菌数

2.2枯草芽孢杆菌的发酵培养基成分

从图2看出不同培养基组成对枯草芽孢杆菌发酵水平(发酵液活菌数)的影响存在差异。

2.2.1碳源不同碳源处理发酵液的活菌数为蔗糖>淀粉>红糖>葡萄糖>糖蜜>麦麸。蔗糖为碳源时，发酵液活菌数最高，为2.5×109CFU/mL；其次是淀粉，活菌数为2.3×109CFU/mL；其他种类碳源发酵水平均相对较低。不同菌株利用碳源物质具有选择性，利用碳源物质的能力也有较大差别，糖类一般是其较容易利用的碳源和能源物质。该试验初步确定最佳碳源为蔗糖。

2.2.2氮源有机氮源对发酵水平起关键作用，酵母膏作为氮源时，发酵液活菌数最高，为8.6×109CFU/mL；黄豆粉和酵母粉作为氮源时，活菌数较高，分别为5.3×109CFU/mL和4.0×109CFU/mL；其他种类氮源发酵水平较低。硝酸钾和硫酸铵2种无机氮源发酵水平最差，分别为0.25×108CFU/mL和0.10×108CFU/mL。因此，初步确定最佳氮源为酵母膏。

2.2.3磷源不同磷源处理发酵液的活菌数为磷酸二氢钾>1/2磷酸二氢钾+1/2磷酸氢二钾>磷酸氢二钾。磷酸二氢钾为磷源时，发酵液活菌数最高，为4.8×109CFU/mL；磷酸氢二钾为磷源时，活菌数最低，为2.6×109CFU/mL。因此，初步确定最佳磷源为磷酸二氢钾。

2.2.4无机盐氯化钙、硫酸镁、硫酸锰、硝酸钾和氯化钠为无机盐时，其发酵液活菌数分别为2.2×109CFU/mL、1.8×109CFU/mL、1.4×109CFU/mL、1.2×109CFU/mL和1.0×109CFU/mL，均较CK高，表明，其对发酵水平具有不同程度的促进作用；添加三氯化铁、硫酸亚铁和硫酸铜时，发酵液活菌数较CK低，表明，其对发酵水平具有不同程度的抑制作用。因此，最佳无机盐选择氯化钙和硫酸镁。

图2不同培养基组成枯草芽孢杆菌的活菌数

2.3发酵培养基组分的优化

从表2看出，方案10(A3B2C4D3E1)的活菌数最高，为1.58×1010CFU/mL；其次是方案11(A3B3C1D2E4)，为1.35×1010CFU/mL。从表3可知，影响发酵水平各因素的关系为蔗糖(A)>酵母膏(B)>硫酸镁(E)>磷酸二氢钾(C)>氯化钙(D)，因素间最佳水平组合为A3B3C4D2E1，该组合不在设计方案中。验证试验结果表明，最佳组合A3B3C4D2E1条件下，发酵液活菌数达1.73×1010CFU/mL，较方案10(A3B2C4D3E1)和方案11(A3B3C1D2E4)的活菌数高。表明，最佳发酵培养基组成为蔗糖12.0 g/L，酵母膏12.0 g/L，磷酸二氢钾1.25 g/L，氯化钙0.22 g/L，硫酸镁0.30 g/L。

经方差分析，F蔗糖=10.275>F0.05(3，3)=9.28，表明，蔗糖作用达显著水平，在发酵过程中应严格控制蔗糖用量，其他因素作用未达显著水平。

表2 枯草芽孢杆菌培养基优化采用的L16(45)正交试验方案与结果

表3枯草芽孢杆菌活菌数的直观分析

注：K，各因素某一水平结果之和的平均数；R，极差。

Note:K，the average of sum of the results at a certain level of each factor;R，range.

3结论与讨论

研究结果表明，JY24菌株最佳发酵条件为转速240 r/min，温度35℃，初始pH7.0，装液量10%，接种量3%，发酵时间36 h；最佳发酵培养基组成为蔗糖12.0 g/L，酵母膏12.0 g/L，磷酸二氢钾1.25 g/L，氯化钙0.22 g/L，硫酸镁0.30 g/L。该条件下，发酵液活菌数达1.73×1010CFU/mL。与对照相比，不同无机盐对发酵水平具有促进或抑制作用，原因与不同菌株在发酵过程中为适应环境变化对不同无机元素的不同需求量有关。无机盐通常具有维持细胞生物大分子和细胞结构稳定性、参与各种酶活性中心组成、调节培养基渗透压和pH、控制细胞氧化还原电位等作用[24]。在发酵试验中，在注重碳、氮源优化的同时，也应特别注意对某些无机盐尤其是微量元素进行优化，有时微量元素也会成为制约、抑制菌株新陈代谢等发酵指标的一个关键因素。

陈莉等[25-26]报道，枯草芽孢杆菌K-6-9和NBF-809菌株液体发酵水平分别为1.40×109CFU/mL和3.98×109CFU/mL，发酵水平相对较低。赵达等[27-28]分别优化不同枯草芽孢杆菌菌株的液体发酵条件，发酵水平分别为1.05×1010CFU/mL和1.10×1010CFU/mL，发酵水平相对较高；管国强等[29]报道，枯草芽孢杆菌ZC1菌株液体发酵水平为3.69×1010CFU/mL，发酵水平相对很高。郑双凤等[30-31]分别优化不同枯草芽孢杆菌菌株的高产芽孢发酵工艺，芽孢产量分别为7.33×109CFU/mL和1.43×1010CFU/mL。综合看，不同枯草芽孢杆菌菌株发酵水平存在一定差异，对特定的菌株需要筛选适宜的培养基配方及发酵条件。下一步将对JY24菌株进行发酵放大和中试生产，进一步提升JY24菌株的发酵水平，同时确定一套发酵工艺参数。