基于纳米金属-有机骨架UiO-66的Hg(Ⅱ)荧光生物传感器的设计

2019-11-07覃亮徐境荣黄焕李树梅罗楚敏

生物化工 2019年5期

覃亮，徐境荣，黄焕，李树梅，罗楚敏

（肇庆学院食品与制药工程学院，广东肇庆 526061）

汞（Hg）是一种剧毒非必需元素，具备难降解、易富集的特征，是在生态系统中能完善循环的惟一重金属[1]。2017年10月27日，在世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单中，汞和无机汞化合物在3类致癌物清单中。

研究发现，汞离子（Hg2+）可以和核酸分子中的胸腺嘧啶（T）发生特异性结合，形成T-Hg2+-T键的复合物，可以显著提高T-T错配的稳定性[2]。2011年，Liu的科研团队首次设计出基于氧化石墨烯（Grapheneoxide，GO）的DNA荧光传感器[3]。虽然基于GO的荧光传感器较传统的Hg2+检测法表现出灵敏度高、检出限低、选择性好、操作简单等优点，但受限于材料生产，存在价格较高的问题[4]。

UiO-66是2008年由挪威奥斯陆大学研究开发的一种基于Zr的金属-有机骨架材料[5]，该材料不但具有GO的性能，而且具有合成方法温和、可控性高、孔洞大小可调节的优势，在气体分离、磁共振成像、生物医药、化学传感器等方面具有潜在的应用价值[6-7]。到目前为止，基于UiO-66的Hg2+荧光传感器的研究还尚未见报道。因此，本实验将UiO-66应用于水溶液中Hg2+荧光传感检测技术中，有利于更好地开展新型的检测方法的研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

本实验所用四氯化锆，对苯二甲酸，苯甲酸，N,N-二甲基甲酰胺，无水乙醇均购于上海麦克林生化科技有限公司，实验所用探针DNA（Probe DNA，P-DNA）片段购自Sangon公司，其中P-DNA以6-羧基荧光素（6-FAM）作为荧光标记物，具体序列如下：

P-DNA： 5' -FAM-TTCTTCTTCGCGTTGTT-3'

D8 ADVANCE X射线衍射仪（德国布鲁克公司）、DTG-60H差热-热重联用仪（日本岛津公司）、JEM-2100F场发射透射电镜仪（日本电子株式会社）、F-7000荧光分光光度计（株式会社日立制作所）。

1.2 UiO-66的合成方法及其表征

1.2.1 UiO-66的合成与纯化

将四氯化锆(ZrCl4)（3.0083 g，0.0129mol），对苯二甲酸（2.1431 g,0.0129mol）和苯甲酸（31.4463 g,0.2575mol）溶于N,N-二甲基甲酰胺（DMF）（170 mL，1.030mol）并置于烧杯中，超声30 min至完全溶解；转移至250 mL聚四氯乙烯内衬的不锈钢反应釜中，120℃反应24 h。得到乳白色混悬液，离心，得白色沉淀；依次加入适量的DMF，无水乙醇各洗涤沉淀物3次，自然干燥后得UiO-66。

1.2.2 场发射透射电镜（FESEM）分析

取干燥的UiO-66置于场发射环境扫描电镜仪的样品台中，观察晶体的表面形貌。

1.2.3 X-射线衍射（XRD）分析

设置管压为40 kV，电流为40 mA，在2θ为5o～60o范围内进行扫描，扫描速度为5o/min。完成数据收集后，使用Origin分析软件将X射线谱图与标准卡片比对，以确定UiO-66是否成功合成。

1.3 UiO-66结合P-DNA的荧光淬灭性能

将2 mL P-DNA的水溶液（含1 μL500μmol/L P-DNA）置于荧光比色皿中，作为待滴定液；将UiO-66混悬配成500 μmol/L（含500μmol/LP-DNA）的溶液为滴定液。将滴定液按体积梯度加入比色皿中，记录体系荧光强度的变化（λex=480 nm）直到荧光淬灭达到饱和，此时得到的复合体系为P-DNA@UiO-66。荧光淬灭效率QE用公式（1）计算。

其中，F0为P-DNA初始荧光强度；FM为加入UiO-66后体系荧光淬灭达到饱和时的荧光强度。

1.4 P-DNA@UiO-66对Hg2+的荧光复苏性能

在上述实验基础上，将稀释后的Hg2+溶液加入到荧光淬灭达到饱和的P-DNA@UiO-66复合体系中，监测荧光强度随时间的变化，确定体系荧光复苏达到饱和时的荧光强度。荧光复苏效率RE用公式（2）计算。

其中，FT为加入Hg2+后复苏达到饱和时的荧光强度。

1.5 荧光各向异性（FA）测定

为了进一步证明化合物与P-DNA之间存在相互作用，设定激发波长为480 nm，测定P-DNA，P-DNA@UiO-66体系，P-DNA@UiO-66+Hg2+体系，P-DNA@Hg2+体系的荧光各向异性值。

2 结果与分析

2.1 UiO-66的FESEM分析

通过场发射环境扫描电镜仪，观察到制备的纳米级UiO-66大小均匀，具有良好的分散性，如图1所示。

图1 本实验制备的UiO-66的FETEM图

2.2 XRD分析

实验结果表明，合成的UiO-66的整体峰型与模拟的UiO-66 XRD衍射峰的位置一致（图2），说明UiO-66晶体制备成功，而且纯度较高。

图2 本实验制备的UiO-66的XRD图

2.3 P-DNA@UiO-66的荧光淬灭性能分析

通过荧光滴定实验，考察了UiO-66对P-DNA的荧光淬灭效果，实验结果如图3所示。

图3 UiO-66的淬灭曲线组合图

通过图3可得知，随着UiO-66悬浊液的加入，P-DNA的荧光强度逐渐减弱。当UiO-66溶液加入的浓度约为15.5μmol/L时，P-DNA的荧光淬灭程度达到饱和。

2.4 Hg2+对P-DNA@UiO-66的荧光复苏性能分析

通过荧光复苏实验，考察了Hg2+对P-DNA@UiO-66的荧光复苏效果，可以观察到体系的荧光强度缓慢复苏，实验结果如图4所示。当Hg2+浓度约为100 μmol/L时，P-DNA@UiO-66体系的荧光复苏强度达到饱和，荧光强度不再发生变化。实验结果表明，P-DNA@UiO-66体系对Hg2+具有有效的检测能力。

图4 荧光复苏曲线组合图

2.5 荧光各向异性测定结果分析

通过荧光各向异性实验，考察了P-DNA、P-DNA+MOF（金属有机骨架）、P-DNA+MOF+Hg2+的荧光各向异性值（FA），实验结果如图5所示。在未加入UiO-66前，P-DNA的FA约为0.078，加入UiO-66后，P+MOF的FA约为0.206，是单独P-DNA存在时的2.64倍。加入Hg2+后，体系FA下降为0.118。