酶法水解牛骨蛋白制备蛋白胨生化试剂的工艺

黄菊，杨君丽，曾吉伟

（南宁庞博生物工程有限公司，广西南宁 530031）

蛋白胨是蛋白质经酸、碱或酶水解得到的一种由胨、肽、氨基酸等组成的混合物，富含有机氮化合物、维生素和糖类，可作为微生物培养基中最主要的基础成分。从骨中提取蛋白胨，传统方法采用酸、碱水解法。酸水解色氨酸会被完全破坏掉，天门冬酰胺和谷氨酰胺将会转变为天门冬氨酸和谷氨酸，半胱氨酸转变为胱氨酸，丝氨酸和苏氨酸会发生部分水解。碱水解会破坏精氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、丝氨酸和苏氨酸。碱法水解蛋白会使L-氨基酸变成D-氨基酸，还可形成具有毒性的Lys-ALa复合物。且酸碱法产生会产生大量废水，造成环境污染，治理成本高。

酶水解法是利用动植物或微生物的蛋白酶，在一定pH、温度、浓度下添加生物酶进行水解，水解蛋白质的氨基酸不会受到破坏，也不会产生消旋作用。酶法水解温度较低，反应时间较短，工艺简单易控制，产品理化性质稳定。本文主要针对酶法水解牛骨蛋白的工艺进行研究，筛选出适合蛋白酶及其合适的酶解温度、pH值、浓度及添加量等工艺条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜牛骨：南宁鲁班路肉联厂；蛋白酶：胰酶、碱性酶、木瓜酶、复合酶（南宁庞博生物工程有限公司）；主要试剂：氢氧化钠、盐酸、甲醛、硫酸等试剂均为市售分析纯、细菌、胰蛋白胨（北京奥博星生物技术有限公司）；氨基酸标准品购于Sigma。

1.2 仪器与设备

PHS-3C精密pH计（上海精密科学仪器有限公司）；L8900型氨基酸自动分析仪（日立）、JC-DN-04C型凯氏定氮仪（青岛聚创环保设备有限公司）、YJ501型恒温水浴锅（上海实验仪器厂有限公司）、LS-B75L型蒸汽灭菌器（江阴滨江医疗设备有限公司）、、JB-2型恒温磁力搅拌器（上海智光器具记器公司）、BS210S型电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）。

1.3 供试菌种及培养基

金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌，均由广东微生物研究所实验室保存；营养肉汤培养基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨8.5 g，氯化钠 3.5 g，蒸馏水1000mL，pH 7.4。

1.4 试验方法

1.4.1 试验工艺流程

新鲜骨头→粗碎→熬煮→去渣、去油→酶解→高温灭活→过滤→喷雾干燥→成品→理化检测→细菌培养。

1.4.2 检测方法

游离氨基酸含量测定：甲醛滴定法，采用参考文献[1]方法；总氮含量测定：凯氏定氮法，采用参考文献[2]方法；蛋白胨含量测定：酸溶性蛋白检测法，采用参考文献[3]方法；氨基酸含量检测：氨基酸检测法采用参考文献[4]方法；水分含量测定：105℃恒重法，采用参考文献[5]方法；灰分的测定：采用参考文献[1]方法。

2 结果与讨论

2.1 骨头蒸煮熬制方法选择

新鲜牛骨原料中蛋白质含量约14.27%、脂肪28.55%、钙14.01%、水分20.9%，骨头熬制是提取骨蛋白的重要操作，骨汤蛋白含量影响着生产的收率及产品的质量。试验设定不同熬制方式进行（表1），以骨汤总蛋白含量和游离氨基酸为指标，实验结果见图1和图2。

综合总氮含量（图1）和游离氨基酸含量（图2）来看，方法5的蒸煮方法整体效果更好，可为后面水解提高游离氨基酸含量提供重要帮助，该蒸煮工艺的游离氨基酸含量已经接近常规蛋白胨产品（游离氨基酸含量≥2.0%）要求，对后续生产成本用酶成本及水解耗能耗时成本的缩减提供了重要帮助。

表1 骨头熬制条件

图1 不同骨头熬制方法总氮含量对比图

2.2 蛋白酶的筛选

采用蛋白酶、胰酶、木瓜蛋白酶、复合蛋白酶分别水解处理牛骨汤，结果见图3。从试验可以看出，复合蛋白酶的作用较强，水解6h后，游离氨基酸达到3.26%，其次为胰酶，游离氨基酸含量2.75%，木瓜酶水解能力最低，游离氨基酸2.0%左右。原因复合蛋白酶中多种酶系，可以同时对蛋白质肽链不同位点进行剪切，使其快速被分解成小肽及氨基酸。本文进一步研究复合蛋白酶的使用工艺条件等。

图2 不同骨头熬制方法游离氨基酸含量对比

2.3 复合蛋白酶使用工艺条件研究

2.3.1 酶解添加量

由图4可知，随着复合酶用量的增大，产品游离氨基酸含量逐渐增加，但当复合酶用量达到0.4%（底物量计）时，产品游离氨基酸含量基本达到最高点3.8%，再继续增加酶的用量，游离氨基酸含量提高的幅度不大，基本平稳。因此，综合生产成本考虑，建议生产用酶，添加量为0.4%（底物量计）即可。

图3 不同酶的酶解能力对比

图4 复合酶不同用量对游离氨基酸含量的影响

2.3.2 酶解时间

从图5数据得知，随着酶解时间的延长，游离氨基酸含量逐渐增加，当水解时间达到16h后，游离氨基酸含量达到最高值4.38%，再往后延长时间水解，游离氨基酸也基本平稳。从生产成本考虑，建议生产时间为16h。

图5 复合酶不同水解时间游离氨基酸含量效果对比

2.3.3 酶解pH值

复合酶是多种不同酶复合在一起使用的，各个酶的最佳作用pH值不同，因此，需要重新找到一个适合该酶用的最佳pH值范围。从图6可以看出，新鲜牛骨汤pH为中性7.5左右，加蛋白酶水解0.5h后，蛋白酶迅速将蛋白肽链末端切断成氨基酸，水解物中氨基酸含量高致使pH下降，pH值迅速下降至6.0左右后趋于平稳状态。因此，生产水解过程中前3h需要时刻关注调整pH值。

图6 复合酶不同PH值水解对游离氨基酸含量效果对比

2.4 骨蛋白胨酶解产品氨基酸结果分析

将新鲜骨头按照工艺“骨头1∶2加水→加复合蛋白酶→55℃酶解1h→0.2MPa压6h→过滤→取清汤浓缩至12%浓度→加复合蛋白酶0.4%（汤量计）→55℃水解16h，控制pH6.5→高温灭活→过滤→喷雾干燥（或冷冻干燥）→成品”生产出来的产品进行氨基酸成分对比分析，结果如表2所示。

牛骨汤原料酶解前各类游离氨基酸含量都很低，总游离氨基酸仅0.727%，水解后各组分氨基酸成倍增长，谷氨酸、精氨酸、脯氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸等明显增加，总游离氨基酸含量达到4.329%。酶解后，游离氨基酸相对提高5倍左右。而从水解氨基酸含量来看，总氨基酸含量占比80.55%，同时色氨酸≥1.0%，肽链中大部分氨基酸已经被暴露在外边，说明蛋白分子已经基本被分解成小肽和氨基酸。

表2 复合酶水解前后氨基酸成分分析对比

2.5 蛋白胨产品理化指标及培养细菌生产实验结果

2.5.1 骨蛋白胨产品理化指标

骨蛋白胨产品理化指标检测结果见表3，符合标准。

2.5.2 不同蛋白胨培养细菌实验结果

用其对比市售的高优质胰蛋白胨产品培养枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌两种菌体。如图7、图8所示，两种菌在各测试培养基中的生长趋势相似，在试验中没有观察到生长延滞期，细菌从接入培养基后即进入指数生长期，随后是生长稳定期，枯草芽孢杆菌的生长峰值出现在培养36 h左右，而金黄色葡萄球菌长最高点出现在培养24h。两种细菌都是在骨蛋白胨的培养基中生长较好，高峰期OD600值相对市售的胰蛋白胨分别提高21%及26%左右，这说明该骨蛋白胨能够较好地提供细菌生长所需要的氮源营养。

表3 蛋白胨理化指标检测结果

图7 不同培养基中枯草芽孢杆菌的生长曲线

图8 不同培养基中金黄色葡萄球菌的生长曲线

3 结论

牛骨通过复合蛋白酶处理后可生产高质量的蛋白胨，牛骨先通过蛋白酶水解后，高温高压（0.2MPa）蒸煮6h，取骨汤浓缩至15%浓度，按液重计加复合蛋白酶0.4%，55℃水解16h，控制pH6.5，酶解液通过过滤喷雾干燥后所得产品游离氨基酸4.329%、总氮14.86%、水分3.4%、灰分3.7%、pH6.5，水解氨基酸80.55%。其产品作为培养基培养细菌比市售的胰蛋白胨产品OD600值高20%以上。因此，本酶解工艺具有水解时间短、操作条件温和、成本低，产品总氮与生物性好等优点，有利于高品质骨蛋白胨的研发与应用，可推广到实际生产。