复方双参颗粒抗氧化活性与抗衰老作用研究

侯会芳，袁震徽，王振波，姜丽萍,关洪斌,姜志辉*，黄建军*

（1.参园庄生物科技股份有限公司，威海264211；2.威海博源园林管理有限公司，威海264211；3.山东大学（威海）海洋学院，威海264209）

人参来源于五加科人参属植物人参Panax ginsengC.A.Mey的干燥根，主产于我国东北，尤以吉林省产量最大，质量最佳，是我国传统的珍贵药材，大补元气，具有百草之王的称号。人参根据加工方法不同，分为鲜人参、生晒参、红参等产品。《本经》：人参“主补五脏，安精神，定魂魄，止惊悸，除邪气，明目，开心益智。中国药典记载：人参大补元气，复脉固脱，补脾益肺，生津养血，安神益智。用于体虚欲脱，肢冷脉微，脾虚食少，肺虚喘咳，津伤口渴，内热消渴，气血亏虚，久病虚赢，惊悸失眠，阳痿宫冷。近代研究表明：人参具有抗衰老、抗疲劳、抗氧化、抗癌、改善人体免疫力和提高记忆力等作用[1]。

海参属于海参纲（Holothuroidea），是生活在海边至8000米的海洋棘皮动物，距今已有6亿多年的历史，海参以海底藻类和浮游生物为食。海参全身长满肉刺，广布于世界各海洋中。中国南海沿岸种类较多，约有20余种海参可供食用。海参同人参、燕窝、鱼翅齐名，是世界八大珍品之一。海参不仅是珍贵的食品，也是名贵的药材。据《本草纲目拾遗》中记载：海参，味甘咸，补肾，益精髓，摄小便，壮阳疗痿，其性温补，足敌人参，故名海参。海参具有提高记忆力、延缓性腺衰老，防止动脉硬化以及抗肿瘤等作用。

自Harman创立自由基学说以来，人们对自由基的产生及其对机体的危害有了更加深刻的认识，各种疾病如癌症、脏器损伤、衰老、炎症等都与自由基有着密切关系。现代医学已经证实衰老的“元凶”就是自由基——在人体的新陈代谢过程中不断产生的带有不对称电子的原子或分子。自由基侵害人体细胞产生致衰因子mda，致衰因子mda进一步侵害细胞生成脂褐素，脂褐素沉积在人体细胞，造成细胞损伤。随着对天然产物的研究越来越多，人们发现一些天然产物具有抗氧化作用，一些补益滋养类的中药具有抗氧化作用。中药抗氧化及与人工合成的抗氧化剂相比较，具有高效、经济、毒副作用小等明显的优点，近年来，国内外学者在研究中药抗氧化等作用方面取得了显著成绩。为了更好的开发利用参园庄高丽红参，我们对复方双参颗粒抗氧化活性和抗衰老作用进行了实验研究。

1 仪器与材料

1.1 实验仪器

RE52-4旋转蒸发仪 （上海沪西分析仪器厂）；TDL-5台式离心机 (上海科兴仪器有限公司）；XW-80A漩涡混合器（上海精密科学仪器有限公司）；NDJ-1电热恒温水浴锅 （北京医疗电子仪器厂）；722型紫外可见分光光度计 （上海光谱仪器有限公司）；AL204电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）。

1.2 实验材料

参园庄高丽红参（将进口韩国高丽鲜人参，采用韩国红参加工工艺和中国红参加工技术相结合制备而成），配伍威海产海参、昆布、核桃、黑豆、黑芝麻、燕麦、胡萝卜、无花果、大枣、适量麦芽糊精制成复方双参颗粒。

1.3 实验试剂

总抗氧化 （T-AOC）试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）测试盒、丙二醛（MDA）测定试剂盒（试剂盒均购于南京建成生物工程研究所）。

1.4 实验动物：

清洁级(SPF)昆明种小鼠（山东绿叶制药有限公司），雄性，体重 18～22g。

2 实验方法

2.1 复方双参颗粒实验组制剂的制备

取复方双参颗粒100g，加入其重量的8倍水提取3h，过滤，滤液备用；滤渣再加6倍水提取2h，过滤，滤液备用；滤渣再加4倍水提取1h，过滤,合并3次滤液，用旋转蒸发仪浓缩滤液至1 g·mL-1，置4℃冰箱保存，备用。

2.2 动物分组与给药

取健康雄性小鼠80只，随机分为复方双参颗粒实验组、空白对照组，每组40只。采用灌胃方式给药，每日1次，自由摄食与饮水，连续给药20 d，给药体积20 mL·kg-1，空白对照组给予等体积的蒸馏水。

2.3 体内抗氧化活性的 （T-AOC能力、SOD活性、MDA含量）测定

末次灌胃给药30min后，实验组和空白对照组随机各抽取10只小鼠，采用负重游泳模型，致小鼠力竭游泳后，脱颈处死，立即取同部位的一小块肝脏，称重，冰浴下匀浆制备成10%肝脏匀浆液，以3000 r·min-1的转速离心10 min，取上清，按照试剂盒上的说明测定肝脏匀浆中总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量。

计算公式为：

总抗氧化（T-AOC）能力（U/mgprot）=（测定管吸光值-对照管吸光值）÷0.01÷30×反应体系稀释倍数÷所测样本蛋白含量

公式中：0.01：在37℃时，每分钟每毫升样品使反应体系吸光度值每增加0.01，为1个总抗氧化能力的单位；30：体系反应时间为30min。

超氧化物歧化酶（SOD）活性（U/mgprot）=（测定管吸光值-对照管吸光值）÷对照管吸光度÷50%×反应液总体积÷取样量÷组织中蛋白含量

丙二醛（MDA）含量（nmol/mgprot）=（测定管吸光值-测定空白管吸光度）÷（标准管吸光度-标准空白管吸光度）×标准品浓度÷组织中蛋白含量

以上各实验所得数据均采用SSPS 17.0软件对数据进行统计分析，并且采用方差分析检验，数据均以±s表示，P＜0.05和P＜0.01都代表所得数据具有显著性差异。

2.4 体外抗氧化活性的测定

体外抗氧化活性的测定采用对O2-·、·OH的清除能力进行测定，与Vc比较，确定其体外抗氧化活性；羟基自由基的测定参照樊青玲[1]方法，计算清除率；超氧阴离子的测定按文献（Ozsoy et al.2008）方法，计算清除率。

3 实验结果与分析

3.1 实验组影响运动后小鼠体内抗氧化作用的结果

实验结果显示复方双参颗粒实验组能增强体内超氧化物歧化酶SOD的活性，降低由于脂质氧化产生的丙二醛MDA含量，实验组总抗氧化T-AOC能力显著高于对照组（P＜0.01），结果见表 1。

表1 复方双参颗粒实验组影响小鼠肝脏组织中SOD活性、MDA含量及总抗氧化T-AOC能力的结果

3.2 复方双参颗粒实验组影响体外抗氧化活性的结果

实验结果显示，复方双参颗粒实验组对羟基自由基和氧自由基均有清除作用（P＜0.05），且与Vc比较，实验组对羟基自由基的清除效果要好于对超氧阴离子自由基的清除效果，实验结果见表2。

表2 复方双参颗粒实验组影响羟基自由基和超氧阴离子自由基的结果

4 讨论

生物体内最常见的自由基是氧自由基，而氧自由基主要包括超氧阴离子自由基（O2-·)、羟自由基（·OH）、过氧化氢（H2O2）等。自由基学说认为，机体高强度或长时间运动时，体内会产生自由基，过多的自由基会破坏体内氧化攻击和抗氧化保护的平衡。因此一般通过对上述自由基的清除能力来鉴定药物的体外抗氧化活性。当机体剧烈运动时，抗氧化酶的清除作用有限，体内产生自由基会逐渐积累，正常的生理状态下，机体代谢产生的自由基会被体内的一些抗氧化酶和非酶成分如超氧化物歧化酶SOD和谷胱甘肽等清除，从而达到一个稳定的状态。在抗氧化指标的检测中，采用了体外和体内两种实验方法进行，可以更加充分的说明复方双参颗粒抗氧化能力。动物实验表明，如果人为地把生物体中的SOD基因“敲除”掉，这些生物的寿命就会缩短。而如果提高身体里面SOD的水平，这些生物的寿命就会延长一些。但是增加SOD并不会使生物体“永生”，说明衰老还有其他机制。体外抗氧化实验结果显示复方双参颗粒对羟基自由基和超氧阴离子自由基均有明显的清除作用。体内抗氧化实验结果显示，复方双参颗粒可以提高体内超氧化物歧化酶活性，降低氧化物丙二醛的含量，具有良好的抗氧化能力，进而提高抗衰老作用，这与复方双参颗粒中含有的皂苷类、多糖类等成分有关[2～6]。

实验证明复方双参颗粒在抗氧化活性和抗衰老作用方面具有广阔的开发前景，为中药复方在抗氧化活性和抗衰老作用领域进行更深入广泛的人体研究和开发利用提供了理论和实践依据。