长链非编码RNA TMPO-AS1靶向调控miRNA-199a-5p基因对胃癌SGC-7901细胞生物学特性的影响

钟琰,王鹏

胃癌是消化道常见的胃癌恶性肿瘤之一，世界卫生组织调查数据显示，中国胃癌患者的发病率和死亡率是世界平均水平的2倍。胃癌细胞的浸润和转移是大多数胃癌患者的死亡原因[1-3]。尽管手术技术、新的化疗药物和多种新的治疗方案在不断的发展，然而目前针对胃癌的治疗效果依旧有限。长链非编码RNA(lncRNAs)和微小RNA(microRNAs)同属于非编码RNA，其异常表达及相互作用影响了肿瘤的进程，可能是肿瘤新的治疗靶点[4]。LncRNA TMPO-AS1位于染色体12q21.2区域，其异常表达影响癌症的发生和发展[5]。例如，近年的研究表明，在胰腺癌中，lncRNA TMPO-AS1表达水平显著上调，能够促进胰腺癌细胞的增殖和转移[6]。miR-199a-5p作为miR-199a家族成员之一，由人类染色体19p13.2转录的前体RNA所剪切而来。近年来，研究表明，miR-199a-5p在癌症的进展中发挥了重要的调控作用。例如，miR-199a-5p作为抑癌基因抑制了肝癌的恶性表型[7]。目前lncRNA TMPO与和miR-199a-5p的表达与胃癌研究较少，因此本研究拟检测lncRNA TMPO-AS1在胃癌组织和细胞中的表达水平，同时探究了其对胃癌SGC-7901细胞增殖和迁移的作用及下游机制，以期为临床上治疗胃癌提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 标本

选取2017年1月至2018年1月于本院行胃癌切除术的30例原发性胃癌患者的癌组织。术前患者均未接受化疗、放疗等辅助治疗。对照组标本来自于同一患者的癌旁组织(距离病灶至少3 cm)。入选标准:术前未进行放疗或化疗;经镜下观察, 取得距肿瘤边界外超过3 cm的形态学正常的组织(癌旁组织)。根据临床和病理检查结果确定口腔癌分期；取得的标本经40 g/L甲醛固定、脱水及石蜡包埋。所有标本储存在液氮(-196 ℃)中直到用于提取RNA和其他实验。我们的研究获得本院医学伦理委员会批准，所有参与患者均知情同意。

1.2 细胞株、细胞培养及转染

人胃癌细胞系AGS、SGC-7901、MKN-45、MGC-803、BGC-823和正常胃黏膜上皮细胞系GES-1购自中国科学院细胞库。这些细胞均保存于DMEM培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA，United States)，在培养基中加入100 U/mL青霉素G、100 μg/mL链霉素溶液(Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA)和10%胎牛血清(FBS)(Gibco，New York，CA，USA)，并在37 ℃加湿5% CO2孵化器中孵育细胞。每隔3～4 d更换1次培养基。

将SGC-7901细胞，以1×106个/mL的密度接种于60 mm培养板，置于37 ℃、5% CO2温育培养16 h后进行细胞转染。miR-199a-5p mimics、sh-TMPO-AS1、TMPO-AS1过表达质粒及阴性对照物购于广州RiboBio Co, Ltd.(Guangzhou, China)。根据供应商的说明书用Lipofectamine 2000(Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.)转染SGC-7901细胞。用qRT-PCR检测转染效率。转染48 h后，根据细胞密度按1∶3或1∶2分板，使分板后细胞密度为30%左右，37 ℃、5% CO2继续培养30 h，待进一步分析。

1.3 RNA提取与实时PCR分析(qRT-PCR)

根据各基因在GenBank中的序列号，用Primer 6.0软件设计引物。按照实验要求从冷冻组织中提取总RNA，并用TRIzol试剂(Invitrogen, New York, USA)培养细胞。用MMLV逆转录酶(invitrogen, New York, USA)进行逆转录，产生第一链cDNA。在ABI 7500实时PCR系统(Applied Biosystems, San Francisco, CA, United States)上，采用SYBR预混剂EX TAQ II(TaKaRa, Dalian, China)按照制造商的说明进行定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)。qRT-PCR条件如下：95 ℃预变性10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，45个循环，获取荧光信号温度为60 ℃。以GAPDH作为lncRNA TMPO-AS1的标准化内参，U6作为miR-199a-5p的标准化内参，基因表达的结果采用2(-ΔΔCt)方法进行统计。lncRNA TMPO-AS1上游引物序列:5′-AGCCCACACACTACAGGCA-3′，lncRNA TMPO-AS1下游引物序列:5′-GCACAAAAGCAGTACGACCT-3′；GAPDH上游引物序列:5′-TATGATGATATCAAGA-GGGTAGT-3′，GAPDH下游引物序列:5′-TGTATCCAAAC-TCATTGTCATAC-3′；miR-199a-5p上游引物序列:5′-GTCGATACCAGTGCGTGTCGTCCTGTCGGC-3′，miR-199a-5p下游引物序列:5′-AATTGCACTGGATACGACAGCCTAT-3′；U6上游引物序列:5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′；U6下游引物序列:5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′

1.4 CCK-8试验

用CCK-8法测定细胞生长曲线。参照CCK8试剂盒说明书进行。将转染24 h的SGC-7901细胞置于96孔板中，调整细胞浓度为5×103个/mL，分别孵育1、2、3和4 d。然后加入10 μL增强CCK-8(Dojindo, Kumamoto, Japan)，在37 ℃下孵育4 h。各孔在BIO-RAD550酶联免疫检测仪上以450 nm波长测定吸光度A值。每个实验重复3次，测量3次。

1.5 Transwell试验

用DMEM培养液制备细胞悬液，细胞密度为2×105个/ml。取200 μL细胞悬液接种于Transwell小室(8 μm孔径)中，同时在下室中加入600 μL含10%胎牛血清的DMEM培养液；37 ℃细胞培养箱中继续培养36 h后，弃去上室中培养液，用棉签小心拭去小室上层未穿过滤膜的细胞；PBS清洗上室2次后，用4%多聚甲醛溶液固定30 min后风干；置于0.1%结晶紫溶液中染色30 min，PBS清洗3次；于显微镜下随机计数5个视野内穿过膜的细胞数，取平均值，以此反应各组细胞的迁移能力。每组实验重复3次。

1.6 荧光素酶报告试验

用dual-luciferase reporter assay system (Promega, Madison, WI, USA)实施荧光素酶报告基因检测实验。野生型lncRNA TMPO-AS1及突变型lncRNA TMPO-AS1的目的片段被构建并整合入pGL3 vector (Promega, Madison, WI, USA)以构建pGL3-lncRNA TMPO-AS1-wild type (lncRNA TMPO-AS1-wt)和pGL3-lncRNA TMPO-AS1-mutant (lncRNA TMPO-AS1-mut) reporter vector。将lncRNA TMPO-AS1-wt或lncRNA TMPO-AS1-mut与miR-199a-5pmimics或阴性对照物共转染SGC-7901细胞。转染48 h后，按照制造商的说明测定荧光素酶活性。所有实验一式3份，重复3次。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 lncRNA TMPO-AS1在胃癌组织和细胞中表达显著上调

为了证实lncRNA TMPO-AS1在胃癌中的表达水平，我们采用qRT-PCR检测了30例胃癌患者组织和邻近正常组织以及细胞中lncRNA TMPO-AS1的表达。结果显示，与正常组织相比，在胃癌组织中lncRNA TMPO-AS1表达显著上调(图1A)。此外，与GES组相比，AGS、SGC-7901、MKN-45、MGC-803、BGC-823组中lncRNA TMPO-AS1表达水平显著升高(图1B)。AGS、SGC-7901、MKN-45、MGC-803、BGC-823与GES组之间的差异见图1。

图1用qRT-PCR检测lncRNA TMPO-AS1在胃癌组织和细胞系中的表达特点 A：胃癌组织和癌旁正常组织中lncRNA TMPO-AS1的表达水平；B：正常胃黏膜上皮细胞系及胃癌细胞系中lncRNA TMPO-AS1的表达水平(与GES-1组比较，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)

2.2 低表达lncRNATMPO-AS1抑制胃癌细胞的增殖

为了探究lncRNA TMPO-AS1在胃癌中的功能，我们成功在胃癌SGC-7901细胞系中构建了敲低lncRNA TMPO-AS1的细胞系(P<0.05)，见图2A。进一步研究发现，敲低lncRNA TMPO-AS1可以显著抑制胃癌细胞的增殖(P<0.05)，见图2B、表1。

图2敲低lncRNA TMPO-AS1对SGC-7901细胞增殖的影响 A：qRT-PCR法检测敲低lncRNA TMPO-AS1在细胞中的表达水平，B：CCK8法检测敲低lncRNA TMPO-AS1后，细胞的增殖水平

表1 低表达TMPO-AS1后两组细胞增殖水平比较

2.3 低表达lncRNATMPO-AS1抑制胃癌细胞的迁移

为了进一步探究lncRNA TMPO-AS1在胃癌中的功能，每24 h观察迁移的细胞，transwell结果显示，敲低lncRNA TMPO-AS1可以显著抑制胃癌SGC-7901细胞的迁移(P<0.05)，见图3。

2.4 miR-199a-5p是lncRNA TMPO-AS1的靶点

为了探究lncRNA TMPO-AS1和miR-199a-5p之间的潜在关系，我们通过StarBase数据库(http://www.starbase.com)进行了生物信息学分析，数据显示lncRNA TMPO-AS1含有miR-199a-5p的保守结合位点(图4A)。同时，我们采用qRT-PCR检测了胃癌组织中lncRNA TMPO-AS1和miR-199a-5p的表达。我们的结果发现胃癌组织中的lncRNA TMPO-AS1能负向调节miR-199a-5p的表达(图4B)。为了进一步验证lncRNA TMPO-AS1与miR-199a-5p的结合关系，我们采用双荧光素酶报告法进行检测。双荧光素酶报告试验表明，miR-199a-5p模拟物可降低含lncRNA NEAT1-wt的荧光素酶报告体的荧光素酶活性，而对lncRNA NEAT1-mut载体的荧光素酶活性没有显著影响(P<0.05)，见图4C，证明miR-199a-5p是lncRNA TMPO-AS1的靶向miRNA。

2.5 miR-199a-5p在胃癌组织和细胞中表达显著下调

为了证实miR-199a-5p在胃癌中的表达水平，我们采用qRT-PCR检测了30例胃癌患者组织和邻近正常组织以及细胞中miR-199a-5p的表达。结果显示，与正常组织相比，在胃癌组织中表达显著下调(P<0.05，图5A)。此外，与正常胃黏膜上皮细胞系相比，胃癌细胞系中的miR-199a-5p表达水平显著下调(P<0.05)，AGS、SGC-7901、MKN-45、MGC-803、BGC-823与GES组之间的差异见图5B。

2.6 高表达miR-199a-5p抑制胃癌细胞的增殖

为了探究miR-199a-5p在胃癌中的功能，我们成功在胃癌SGC-7901细胞系中成功构建了过表达miR-199a-5p的细胞系(P<0.05)，见图6A。进一步研究发现，过表达miR-199a-5p可以显著抑制胃癌SGC-7901细胞的增殖(P<0.05)，见图6B、表2。

2.7 高表达miR-199a-5p抑制胃癌细胞的迁移

为了进一步探究miR-199a-5p在胃癌中的功能，每24 h观察迁移的细胞，transwell结果显示，过表达miR-199a-5p可以显著抑制胃癌SGC-7901细胞的迁移(P<0.05)，见图7。

2.8 miR-199a-5p逆转了lncRNA TMPO-AS1介导的促进胃癌细胞增殖和迁移的效应

为了分析miR-199a-5p在lncRNA TMPO-AS1促进胃癌进展中的重要性，我们将miR-199a-5p模拟物转染到过表达lncRNATMPO-AS1的细胞中。qRT-PCR结果显示，miR-199a-

图3 Transwell法检测敲低lncRNA TMPO-AS1后，SGC-7901细胞的迁移

图4lncRNA TMPO-AS1与miR-199a-5p在胃癌组织和细胞中的表达特点及相互作用关系 A：lncRNA TMPO-AS1与miR-199a-5p碱基互补配对关系；B：qRT-PCR检测miR-199a-5p在胃癌组织中的表达特点；C：采用双荧光素酶报告检测lncRNA TMPO-AS1与miR-199a-5p的靶向关系(**P<0.01)

图5用qRT-PCR检测miR-199a-5p在胃癌组织和细胞系中的表达特点 A：胃癌组织和癌旁正常组织中miR-199a-5p的表达水平；B：正常胃黏膜上皮细胞系及胃癌细胞系中miR-199a-5p的表达水平(与GES-1组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)

图6过表达miR-199a-5p对SGC-7901细胞增殖的作用 A：qRT-PCR法检测过表达miR-199a-5p在细胞中的表达水平；B：CCK8法检测过表达miR-199a-5p后，细胞的增殖水平5p模拟物的转染对lncRNA TMPO-AS1的表达没有显著影响(图8A、B)。此外，过表达lncRNATMPO-AS1促进了SGC-7901细胞的增殖和迁移，而转染了miR-199a-5p模拟物后，与TMPO-AS1过表达组相比，TMPO-AS1/miR-199a-5p组细胞增殖和迁移能力明显下调(P<0.05)，见图8C、D。

表2 转染miR-199a-5p mimics后两组细胞增殖水平比较

图7 Transwell法检测过表达miR-199a-5p后，SGC-7901细胞的迁移

图8miR-199a-5p模拟物的转染对过表达lncRNA TMPO-AS1的SGC-7901细胞增殖和迁移的作用 A：qRT-PCR检测细胞中lncRNA TMPO-AS1的表达水平；B：qRT-PCR检测细胞中miR-199a-5p的表达水平；C：CCK8法检测转染miR-199a-5p模拟物后，细胞的增殖；D：Transwell法检测转染miR-199a-5p模拟物后，细胞的迁移。nsP>0.05，*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001；与TMPO-AS1/miR-199a-5p比较，#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001

3 讨论

在本研究中，通过构建体外模型探讨了lncRNA TMPO-AS1在胃癌病理生理机制中的作用。我们首先发现lncRNA TMPO-AS1在胃癌组织和细胞中表达显著上调，进一步采用lncRNA TMPO-AS1低表达实验证实，lncRNA TMPO-AS1促进了胃癌的增殖和迁移。这些数据表明，lncRNA TMPO-AS1在胃癌中发挥促癌效应。

越来越多的研究表明，lncRNA在肿瘤的发生和发展中发挥重要作用[8-9]。最新的研究显示，NCRNA-TTN-AS1在食管癌中表达显著上调，能够促进食道癌的进展[10]。同时，lncRNA PCA3可以通过调节雄激素受体信号转导通路而促进前列腺癌细胞的增殖和转移[11]。此外，在胃癌中，lncRNA也发挥重要的调节作用。例如，有研究表明，lncRNA ABHD11-AS1在胃癌组织和细胞中表达上调，能促进胃癌的恶性表型[12]。近年来研究报道，lncRNA TMPO-AS1作为促癌基因促进了前列腺癌[13]和非小细胞肺癌[14]的进展。因此，我们猜想lncRNA TMPO-AS1在胃癌的进展中发挥重要作用。与以上研究结果一致，我们发现与癌旁组织相比，胃癌组织中lncRNA HOTAIR的表达水平显著上调，选择性调控实验说明敲低lncRNA TMPO-AS1的水平能抑制胃癌细胞的增殖和迁移[15]。这些结果说明lncRNA TMPO-AS1作为促癌因子促进了胃癌的恶性表型。

目前研究发现的miRNA超过1900种，在哺乳动物中，miRNA可调控超过60%基因表达[16]。目前认为miRNA在肿瘤中也起重要作用。例如，miR-449a通过靶向CDC25A(Cell division cycle 25A, CDC25A)抑制子宫内膜癌的增殖和转移[17]。与以上研究结果类似的是，miRNA-10a可通过上调GLUT1(Recombinant Glucose Transporter 1, GLUT1)和促进葡萄糖代谢来促进口腔鳞状细胞癌中的癌细胞增殖[18]。此外，大量研究发现miRNAs在胃癌中作为抑癌或促癌基因，参与胃癌的进程[19]。例如，miR-218通过靶向LASP1(LIM and SH3 protein 1, LASP1)抑制胃癌的恶性表型[20]。同时，miRNA-383-5p通过靶向调节HDAC9(histone deacetylase 9, HDAC9)抑制胃癌的恶性表型[21]。此外，在胃癌中，miR-561表达显著下调，能抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力[22]。而miR-199a-5p在肝癌[7]、非小细胞肺癌[23]、胶质瘤[24]中均显著下调，能够通过靶向下游的mRNA抑制相关癌症的进展。鉴于以上研究基础，我们猜测miR-199a-5p在胃癌的进展中发挥重要作用，有趣的是，我们发现miR-199a-5p在胃癌组织和细胞中表达上调，miR-199a-5p模拟物的转染能减弱胃癌细胞的增殖和迁移。这些结果说明miR-199a-5p作为抑癌基因，抑制胃癌的恶性表型。

最近，lncRNAs通过与miRNAs相互作用并抑制其作用而起到ceRNA或miRNA分子海绵的作用。例如，在胶质瘤中，lncRNA KCNQ1OT1通过miR-370/CCNE2轴促进胶质瘤细胞的增殖和转移[25]。同时，在直肠癌中，lncRNA HOTAIR通过抑制miR-218和激活NF-κB/TS信号，促进5FU抵抗[26]。此外，有研究表明，在胃癌中，LncRNA SPRY4-IT1通过靶向调节miR-101-3p促进胃癌的进展[27]。与以上研究结果类似的是，LncRNA GAS5通过靶向miR-106a-5p的表达水平抑制胃癌的恶性表型[28]。此外，lncRNA ABHD11-AS1通过靶向miR-199a-5p上调SLC1A5的水平促进乳头状甲状腺癌的进展[29]。受“competitive endogenous RNAs”调节网络和新出现的表明lncRNAs可能参与这种调节的证据启发，我们假设lncRNA TMPO-AS1也可能是一种ceRNA，因此我们探究了lncRNA TMPO-AS1与miR-199a-5p的潜在相互作用。生物学信息和双荧光素酶分析证实lncRNA TMPO-AS1能特异性结合miR-199a-5p，功能性实验表明lncRNA TMPO-AS1能负向调节miR-199a-5p的表达，且过表达miR-199a-5p能逆转lncRNA TMPO-AS1促进胃癌恶性表型的效应。这些数据证明了lncRNA TMPO-AS1可能是胃癌细胞中的miR-199a-5p分子海绵。

总之，我们的研究证明了lncRNA TMPO-AS1在胃癌组织和细胞中表达水平显著上调。功能性实验证实lncRNA TMPO-AS1通过靶向调控miR-199a-5p促进胃癌细胞增殖和迁移，是一个有价值和有前景的胃癌治疗靶点。本研究仍然存在一些不足之处，如收集样本量较少，并且无体内实验。今后仍需通过临床多中心、大样本实验、体内实验进一步进行临床验证。