RNA干扰Twist基因表达对结直肠癌细胞HCT116增殖和凋亡的影响

钱江 朱春丽 杨钦文 陈鹏 傅仲学

(1.重庆市垫江县中医院普外科，重庆 408300；2.重庆医科大学附属第一医院普外科，重庆 400010)

结直肠癌(CRC)是国内第三常见的恶性肿瘤疾病，也是世界第四常见的死亡原因[1-2]。尽管在早期诊断率、综合治疗的有效性、手术切除率以及术后存活率方面都有所提高，但根治CRC的方法仍然有限，结肠癌细胞的侵袭和转移削弱了治疗效果，导致高死亡率。转移与细胞逐渐失去上皮表型并获得间充质表型的生物转化过程密切相关，称为上皮—间充质转变(EMT)[3]。EMT的特征是上皮表面标志物，特别是E-钙粘蛋白(E-cadherin)的丢失。在乳腺癌、前列腺癌、肝癌和肺癌中EMT是肿瘤进展的重要步骤之一，是肿瘤细胞侵袭能力增强的必要条件。我们前期研究也证明了Twist和E-cadherin蛋白的表达可能与结直肠癌的发生发展和侵袭转移相关，Twist和E-cadherin蛋白表达呈负相关关系提示，在上皮-间质转化过程中可能是通过抑制E-cadherin蛋白的表达来实现的[4]。E-cadherin在胚胎发育和形态发生、细胞增殖、存活、侵袭和迁移中起重要作用。本文通过Twist基因shRNA慢病毒表达载体转染人结直肠癌HCT116细胞，观察其在体外对细胞增殖和凋亡的影响，为结直肠癌基因靶向治疗提供依据。

1 材料和方法

1.1材料和试剂 人结肠癌细胞株HCT116由中科院上海细胞研究所提供，pTracer-CMV/BSD-Twist和pTracer-CMV/BSD质粒来源于重庆医科大学生科院实验室。上海吉凯基因化学技术有限公司设计构建了pGenesil-Twist-shRNA、pGenesil-GFP Vector和pGenesil-shRNA三种质粒。成功构建质粒，经DH5α转化，从大肠杆菌中提取纯化。DNA的双限制酶消化使用酶NheI、BsaI、SacI和EcorI，并且我们进行琼脂糖凝胶电泳以确认和分离消化的DNA。所有序列均经上海吉凯基因化学技术有限公司确认。

1.2方法

1.2.1细胞培养和转染 用含二甲基亚砜(DMSO)低温保护剂来储存低温保存的培养细胞，参照说明书，使用脂质体Lipo2000试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)转染细胞。实验分组为：空白对照(control)组，阴性siRNA(negative siRNA)组和TwistsiRNA转染组。

1.2.2Real-time PCR检测Twist、E-cadherin基因mRNA的表达 用三唑试剂(Invitrogen)从转染细胞中提取总RNA，采用高容量cDNA逆转录酶(Invitrogen)进行cDNA合成，定量实时PCR检测Twist和E-cadherin的相对表达水平。测定三个基因mRNA的相对表达，并标准化为参考基因GAPDH的表达。引物用于PCR扩增的引物有：Twist上游引物： 5’-GGAGTCCGCAGTCTTACGAG-3’;下游引物：5’-TCTGGAGGACCTGGTAGAGG-3’; E-cadherin上游引物：5’-GTGTCATCCAACGGGAATGC-3’，下游引物：5’-TGGCGGCATTGTAGGTGTTC-3’。用荧光定量实时PCR仪和SYBR选择母体混合液进行40个周期的qPCR扩增，包括三个步骤：变性温度为1 min，引物退火温度为54 ℃为45 s，延伸温度为72 ℃为2 min。用ΔΔCt法计算mRNA相对含量。

1.2.3Western blot法检测HCT116结肠癌细胞中Twist、E-cadherin的表达 转染48 h的细胞在冰上在裂解缓冲液中裂解30 min。将细胞提取的等量蛋白质应用于十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶，并转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜。在4 ℃下，将抗Twist、抗E-cadherin和抗GAPDH(1∶1 000稀释)一起孵育过夜。膜是用辣根过氧化物酶(HRP)偶联多克隆抗体(1∶1 000)在室温下洗涤和孵育2 h。用Bradford蛋白测定试剂盒测定印迹蛋白。

1.2.4MTT法测定HCT116细胞增殖活性 胰酶消化对数生长期细胞，制备浓度为1～108cells/L单细胞悬液，96孔板每孔接种100 μL，基因沉默方法同前，MTT比色法检测转染后1、2、3、4、5、6和7 d 细胞增殖活性和生存能力。

1.2.5流式细胞术检测 细胞周期绿色荧光蛋白(GFP)编码的DNA质粒在转染后48 h在倒置荧光显微镜IX70下表达绿色荧光。当细胞处于对数生长期时，采用胰蛋白酶化法获得细胞，流式细胞仪检测细胞周期。

2 结 果

2.1Real-time PCR检测Twist、E-cadherin基因的表达 病毒感染HCT116结肠癌细胞后，通过Real-time PCR 检测可见转染组Twist基因表达明显低于空白对照组和阴性对照组细胞中Twist基因的表达水平，有明显的抑制作用(P<0.05)(图1)。转染组E-cadherin基因表达明显高于空白对照组和阴性对照组细胞中E-cadherin基因的表达水平(P<0.05)，见图2。

图1Twist基因沉默在结肠癌HCT116细胞Twist mRNA表达图2E-cadherin基因沉默在结肠癌HCT116细胞E-cadherin mRNA表达

2.2Western blot检测Twist基因在HCT116结肠癌细胞中表达 pGCSIL-GFP-shTwist慢病毒对Twist蛋白表达的变化，与空载体组对照相比，转染组Twist蛋白的表达量显著降低(图3)(P<0.05)。与空载体组对照相比，转染组E-cadherin蛋白的表达量显著增高(图4)(P<0.05)。

注：1.Blank control group；2.Negative control group；3.Twist siRNA group。

图3Twist基因沉默在结肠癌HCT116细胞Twist蛋白表达

注：1.Blank control group；2.Negative control group；3.Twist siRNA group。

图4Twist基因沉默在结肠癌HCT116细胞E-cadherin蛋白表达

2.3转染细胞的MTT增殖试验结果 HCT116细胞增殖能力在转染pGCSIL-GFP-shTwist沉默Twist基因后明显降低，且干扰组细胞增殖生长速度较另外两组细胞缓慢，在第4、5、6天与第7天，显著差异(n=3，P<0.05)， 而阴性对照组与空白组间吸光度值无显著差异(n=3，P>0.05)。实验结果表明，转染pGCSIL-GFP-shTwist慢病毒载体后，对结肠癌细胞HCT116的生长具有明显抑制作用(图5)。

图5 转染HCT116细胞Twist基因MTT增殖结果

2.4流式细胞术检测细胞周期 HCT116细胞周期在Twist基因沉默后发生变化，Twist转染组G0/G1期细胞百分比与阴性对照组相比，明显增加(P<0.05)，S期细胞百分比和阴性对照组比较，有所减少，G2/M期细胞百分比低于对照组(34.2±0.6)。上述结果表明：沉默Twist基因能够将细胞阻滞于G0/G1期，细胞分裂明显缓慢，见表1。

表1 三组结肠癌HCT116细胞周期各期百分率比较

注：与阴性对照组比较，aP<0.05。

3 讨 论

结直肠癌是世界上最常见的疾病之一，其发病率呈逐年上升趋势[5]。尽管在病因和病理生理学存在着差异，但两者都对该病生物学过程起至关重要的作用。其中之一就是上皮—间充质转变(EMT)，它在人体发育过程中起重要作用，参与结直肠癌的发生和发展，在组织纤维化过程中起重要作用[6]。参与EMT的细胞表现出许多形态和特征改变，如：细胞粘附力丧失、E-钙粘蛋白的抑制和细胞活力增加[7]。同时，酪氨酸激酶的激活或升高，N-钙粘蛋白、波形蛋白、纤维连接蛋白、锌指结构域蛋白和碱性螺旋环结构域蛋白的上调，同时Twist基因表达与间充质样表型有关[8]。在基础研究中，这些基因常被作为EMT的标志物，表明细胞具有很强的运动性和侵袭性。体外和体内实验研究表明，EMT在原发性浸润性乳腺癌、肺癌、前列腺癌、肝癌和胰腺癌等恶性肿瘤和继发性转移中起重要作用。关于Twist基因在诱导和调节中的作用以及在结肠疾病发病机制中的作用的数据在科学文献中却很少。因此，本研究选择了与肿瘤进展和转移密切相关的Twist基因。

本实验在结肠癌HCT116细胞应用RNA沉默技术，下调Twist基因的表达，shRNA慢病毒载体转染后，结肠癌HCT116细胞中TwistmRNA和蛋白表达量明显减少，E-cadherinmRNA和蛋白表达量明显增多，说明结直肠癌发生与EMT有关，本实验表明，干扰Twist基因转录水平和蛋白表达后可明显抑制结肠癌细胞的增殖。Twist基因沉默后，HCT116细胞在G0/G1期出现阻滞，提示沉默Twist基因后可以抑制细胞分裂，Twist基因可能是引起细胞周期改变，从而在结直肠癌的恶性增殖中发挥十分重要的作用。

总之，从目前的实验结果来看，Twist基因的上调可促进EMT分子事件发生，增强肿瘤细胞的转移能力，而Twist-shRNA能有效地抑制HCT116细胞系Twist基因的表达，升高E-cadherin基因的表达，促进间充质上皮的转变，有效抑制结肠癌细胞的迁移和侵袭。Twist和E-cadherin表达在CRC的发生发展中起着重要作用。Twist和E-cadherin在CRC中的激活和失活可以作为预后因素和癌症治疗靶点，并为下一步的动物实验打下基础。

(本文图3～4见封三)