迪澳结核分枝杆菌恒温核酸检测法、Xpert MTB/RIF检测法与传统固体罗氏培养法的比较

韩 珍，朱惠慧，范远珍

(惠州市职业病防治院/惠州市结核病防治研究所 检验科，广东 惠州 516008)

结核病在临床上较为常见，是由结核分枝杆菌引起的慢性传染性疾病，已经成为了全世界共同面对的卫生问题，现发展形势不容乐观[1]。结核分歧杆菌是人类致病的主要分歧杆菌，对机体各器官均会造成严重影响，肺部感染便是其中之一，具有较高的发病率和致死率。目前，国际上对于结核病的控制，主要是针对其早期防治和治疗[2]，由此看来，对于结核分枝杆菌的早期检测是至关重要的。结核分枝杆菌的检测方法比较多，其中迪澳恒温核酸检测、Xpert检测、固体培养以及痰涂片是四种较为常见的方法，并已被广泛应用[3]。本研究为进一步了解迪澳恒温核酸检测、Xpert检测、固体培养以及痰涂片四种检测法在结核分枝杆菌检测中的应用，选取400份结核分枝杆菌标本纳入样本中展开分析，取得了理想的效果，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2018年6月至2019年5月间在惠州市结核病防治研究所结核科就诊的400份结核病患者标本作为研究对象。全部患者中，男性患者264例，女性患者136例。年龄21～86岁，平均年龄(56.43±2.38)岁。对所有患者的痰液进行检测，分析不同检测方法的效果。纳入标准：(1)根据原卫生部发布的《肺结核诊断标准(WS288-2008)》的临床症状、体征及胸部影像学确诊；(2)初诊病案信息齐全；(3)签署知情同意书；(4)经控制中心伦理委员会批准。排除标准：(1)信息不全者；(2)依从性不高者。

1.2 方法

1.2.1 迪澳恒温核酸法 取1 mL样品加入到1.5 mL可立细菌保存管中，10000 r/min(离心半径25 mm)，离心5min。吸弃上清液，沉淀加入l mL纯净水重悬洗涤，10000 r/min(离心半径25 mm)，离心5min，吸弃上清液。沉淀加入Mtb的DNA提取缓冲液100F1，混匀，于100℃水浴或金属浴加热10min，冷却后，10000 r/min(离心半径25 mm)，离心2 min。吸取上清液10μL加入室温解冻的恒温扩增反应管内，并设置阴性(试剂内提供的超纯水)和阳性(试剂内提供的含有IS6110 PCR片段的pMDl8-T克隆质粒)对照，分别与反应体系混匀后，10000 r/min离心1 min(离心半径15～35 mm，双排16孔方形转子)，置于Deaou-308C恒温扩增荧光检测仪中，输入每位检测管患者的姓名，设定反应条件为63℃，45 min。Deaou-308C恒温荧光检测仪启动后自动运行并实时记录反应进程，以出峰时间和荧光扩增曲线显示结果。出现扩增曲线为阳性(含有Mtb复合群)，无扩增曲线为阴性。

1.2.2 Xpert检测 按试剂盒的说明书操作。将痰与处理液1:2混合，震荡混匀后，处理15min。取处理后的标本2mL加入Xpert反应试剂盒，将反应试剂盒放入Gene Xpert仪器，开始测试，自动过滤洗涤样品，自动超声破碎样品，提取、纯化DNA，水化试剂珠，将样品DNA和试剂混合物移入反应管，PCR循环和实时检测，最后，仪器自动判读结果。Xpert对MTB的结果分为：MTB检出和未检出。CT是指探针循环阈值，△CT指探针早期CT值与晚期CT值之差，Xpert对RIF耐药的检测结果分为：RIF Resistance检出，△CT>4.0，RIF耐药；RIF Resistance未检出，△CT≤4.0，RIF敏感。

1.2.3 痰涂片法和罗氏培养法 痰涂片法(Zhiel-Neelsen染色法)和罗氏培养法(L-J培养基)的具体操作参考2015版中华医学会《结核病实验室检验规程》和中国防痨协会《结核病诊断细菌学检验规程》。

1.3 统计学分析数据分析使用SPSS 21.0统计软件，计数资料采用[n(%)]表示，组间比较采用卡方检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四种检测方法的阳性率比较迪澳恒温核酸检测法和Xpert检测检测法均高于固体培养检测法和痰涂片检测法，差异有统计学意义(P<0.05)。如表1所示。

表1 四种检测方法的阳性率比较[n(%)]

注：迪澳恒温核酸检测与Xpert检测同固体培养和痰涂片比较，*P<0.05

表2 各种检测法检测情况比较

2.2 四种检测法检测情况比较四种检测方法与金标准的敏感度、特异度、阳性预测值等情况的比较，如表2所示。对迪澳恒温核酸检测法、Xpert检测、固体培养以及痰涂片进行Kappa检验，检测结果一致性均比较高，K值分别为0.523，0.769，0.627，0.546。

3 讨论

结核分枝杆菌分裂一代需要15h～20h，以结核分枝杆菌生长为基础的传统固体培养和比例法体外药敏试验需要时间为4周～8周，因此，在临床诊疗过程中有可能延误治疗。目前，全球结核病实验室新型分子诊断技术以其快速、简便、灵敏度高等优势得以推广和应用，逐渐改变了只能依靠传统实验室方法检测的局面。

迪澳生物结核分枝杆菌复合群核酸检测系统(恒温扩增法)，一般可在90min内完成检测。一次可对14个样品进行检测，标本液化和DNA提取一次完成，结果自动判读，检测时间短，不受卡介苗及其它非结核分枝杆菌的干扰，灵敏度达43%以上，阳性预测值达98%，菌阳病人检出率达98%，特异性高与痰培养相当，达到95%以上[6-7]。Xpert Mtb /RIF检测方法是一种半巢式实时定量荧光PCR体外诊断技术，该技术是将样品准备、定量PCR扩增和荧光检测集于一身，可在2h内同时检测MTB和利福平耐药情况[8]。该检测系统操作简单，实验过程中基本不产生气溶胶，减少了样本中结核分枝杆菌生物危害的风险，即使在高湿度的环境中也无影响[9]。同时，试剂盒放在独立的空间，减少DNA的污染机会。固体培养和痰涂片均为传统的结核分枝杆菌检测方法，具有较高的使用率，操作成熟度比较高，但在检测的阳性率方面比较低，尽管成本较低，然而出于对培养时间的考虑，与迪澳恒温核酸检测法和Xpert检测相比，仍旧具有较为明显的差距[10]。

本研究结果显示，迪澳恒温核酸检测法和Xpert检测在阳性检出率方面，均高于固体培养和痰涂法(P<0.05)，说明迪澳恒温核酸检测法和Xpert检测具有更高的阳性检出率，而结合当前结核分枝杆菌的检测发展来看，Xpert检测更有发展潜力。在敏感度、特异度、阳性预测值等情况方面，迪澳恒温核酸检测法和Xpert检测的敏感度和特异度要高于固体培养和痰涂法，但相比较差异无统计学意义(P>0.05)。分析原因，可能是因为导致痰标本与药敏所用的培养菌株的结果不一致，以及沉默突变或与低度耐药相关的突变有关。另外，在一致性的评价方面，迪澳恒温核酸检测法、Xpert检测、固体培养以及痰涂片均具有较高的一致性，提示了四种检测方法的应用，相互之间尽管存在一定的差异，但均有较为理想的效果，而这也为联合检测的应用奠定了基础。

整体来看，通过比较，痰涂片法操作简单、快速，但敏感度低，漏检率高；固体培养法是传统的结核分枝杆菌检验的“金标准”，但检验耗时比较长(一般1个月)；Xpert Mtb 法是世界卫生组织及国家结核参比实验室推荐的一种全新的结核病快速检测新方法，快速(2h)、简单且敏感度高，还可同时检测利福平耐药性。因此，联合应用多种检测方法进行检测，会达到更好的效果。