金银花总三萜提取工艺及其抗菌抗氧化活性

常霞 景炳年 范毅 王伟 刘雨晴 李智宁 郭唯 魏磊

摘要：以金银花为原料，乙醇为溶剂，考察超声辅助提取金银花总三萜的最佳工艺。在单因素（料液比、乙醇浓度、超声时间和超声温度）试验基础上，利用响应面法，研究各因素间相互作用及对三萜提取率的影响，获得最佳提取工艺为料液比1 g ∶30 mL、乙醇浓度75%、超声时间50 min、超声温度45 ℃，验证试验结果显示，三萜提取率为371%，与理论值接近;通过微量稀释法检测常见致病菌对金银花总三萜的敏感性，最小抑菌浓度范围在3～24 mg/mL之间，证明金银花三萜具有较强的抗菌作用;DPPH、ABTS自由基清除试验IC50分别为26.1、18.8 mg/mL，说明金银花三萜具有一定的抗氧化活性。本研究為金银花三萜进一步的研究开发提供了科学依据。

关键词：金银花;总三萜;响应面;抗菌;抗氧化;提取工艺

中图分类号：R284   文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）16-0178-05

收稿日期：2018-05-14

基金项目：河南省科技攻关项目（编号：182102310061）;河南省科学院基本科研项目（编号18JK16015）。

作者简介：常 霞（1963—），女，山西陵川人，高级工程师，从事中药化学研究。Tel：（0371）65353099;

通信作者：魏 磊，博士，助理研究员，从事植物化学及分子生物学研究。Tel：（0371）65353099;

金银花是忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥花蕾或初开的花，具有清热解毒、疏散风热之功效，多用于治疗痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温病发热等病症[1]，其药用成分主要包括挥发油、有机酸类、黄酮和三萜类化合物。三萜类化合物具有抗菌、抗病毒、抗癌、抗炎、降血脂、降低胆固醇、增加免疫力等多种药理功能[2-5]，且毒性较低，因此成为中外研究的热点之一[6]。目前，从金银花中已分离出30多个三萜类化合物[7]，并有保肝和利胆的功效[8]，但针对金银花中三萜类化合物的总量、提取工艺及抗菌抗氧化活性等方面的研究未见报道。

提取是回收和纯化生物活性物质最初始且重要的一步，多种因素会影响提取效率和产量[9]，因此优化提取工艺最大程度提取生物活性物质十分必要。超声波提取技术提取效率高、耗能低、不破坏活性成分[10]。同时，响应面法可以对多种影响提取效率的因素及因素间相互作用进行有效性分析[11]。近年来，响应面法结合超声辅助提取技术在优化黄酮[12]、多糖[13]等天然活性成分的提取工艺中得到广泛应用。本研究采用响应面法优化金银花总三萜的超声辅助提取工艺，并考察提取所得的金银花总三萜对人体常见致病菌的抑菌活性及抗氧化活性，旨在为金银花总三萜的进一步研究开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

金银花产自河南省封丘县，由新乡博凯生物技术有限公司提供;7种常见致病菌（大肠杆菌ATCC 25922、金黄色葡萄球菌ATCC 29213、化脓性链球菌ATCC 19615、鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311、肺炎链球菌ATCC 49619、铜绿假单胞菌ATCC 27853、肺炎克雷伯氏菌ATCC 700603）均购自南京便诊生物科技有限公司;齐墩果酸标准品购自中国药品生物制品检定所;胰蛋白胨购自上海宝录生物科技有限公司;牛肉浸膏购自北京双旋微生物培养基制品厂;D-101大孔吸附树脂购自天津市光复精细化工研究所;微量MIC测定板购自美国Corning公司;DPPH、ABTS购自梯希爱（上海）化成工业发展有限公司;无水乙醇、香草醛、冰醋酸、高氯酸等均为分析纯，购自北京化工厂。

ME-204型电子天平;wi93008型麦氏比浊仪;DHP-9082型电热恒温培养箱;SYQ-DSX-280B手提式压力蒸汽灭菌锅;YJ-VS-2型超净工作台;KQ-500E型超声波清洗仪;TU-1810型紫外分光光度计;XMTD-7000型恒温水浴锅;Bio-rad iMarkTM型酶标仪。

1.2 方法

1.2.1 金银花三萜提取工艺流程

金银花打粉后过60目筛，称定1.00 g于100 mL锥形瓶中，以一定料液比加入一定浓度的乙醇溶液，在一定温度下超声提取一定时间，重复3次，滤液合并后浓缩定容，取适量测定总三萜含量。

1.2.2 三萜含量测定方法

1.2.2.1 标准曲线的绘制

以齐墩果酸为标准品，采用香草醛-冰醋酸-高氯酸分光光度法测定总三萜含量。称定标准品4.00 mg，甲醇定容至10 mL容量瓶中。准确移取该溶液0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL分别加入10 mL容量瓶中，挥尽溶剂。加入0.4 mL新鲜配制的5%香草醛-冰醋酸溶液和1 mL高氯酸，摇匀后置于60 ℃水浴中加热30 min。取出冷却至室温，加冰醋酸定容至10 mL摇匀，在550 nm波长下测定吸光度。以齐敦果酸含量x为横坐标，吸光度y为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为：y=28.175x-0.007 3，r2=0.999 2。说明齐墩果酸标准品在0～0.02 mg/mL范围内线性关系良好。

1.2.2.2 三萜含量测定

根据“1.2.2.1”项下回归方程，计算提取液总三萜含量。提取率计算公式为：

三萜提取率=三萜质量浓度×提取液体积×稀释倍数/金银花质量×100%。

1.2.3 金银花提取单因素试验及响应面设计

选定料液比（A）、乙醇浓度（B）、超声时间（C）、超声温度（D）4个因素作单因素试验，在此基础上进行响应面设计，根据Box-Behnken试验设计原理，采用4因素3水平共29组试验对提取工艺进行优化分析，因素水平见表1，试验条件及结果见表2。

1.2.4 金银花总三萜制备

D-101大孔吸附树脂经乙醇和蒸馏水预处理后，湿法装柱，平衡后上样（金银花醇提物），然后用蒸馏水及30%、50%、70%、95%乙醇溶液依次洗脱，收集各项洗脱液，浓缩，冻干，以95%乙醇洗脱项制备金银花总三萜，并将其配制成浓度为96 mg/mL的母液。

1.2.5 抑菌活性测定

1.2.5.1 菌株复苏及菌悬液的制备

上述7种供试菌种复苏后接种于固体培养基上，培养12～24 h。从平板上挑取单个菌落，混悬于液体培养基中，制成浓度为106～108 CFU/mL的菌悬液，备用。

1.2.5.2 最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）的测定

用微量稀释法测定金银花总三萜的最小抑菌浓度。首先用0.22 μm滤膜过滤“1.2.4”节药液母液，用制备好的液体培养基依次倍比稀释成9个浓度后，加入微量MIC测定板中，每孔0.1 mL;再分别加入“1.2.5.1”节的各种菌液，每孔0.1 mL。设置阳性对照（加入0.1 mL菌液和0.1 mL液体培养基）和阴性对照（只加液体培养基）。测定板于37 ℃恒温箱中培养24 h观察结果，完全没有细菌生长时的最低浓度即为最小抑菌浓度。将无菌生长的各孔取样，分别涂布于无菌琼脂平板上，37 ℃培养24 h观察结果，以平板上无细菌生长的最低药物浓度为最小杀菌浓度。

1.2.6 抗氧化活性测定

1.2.6.1 DPPH自由基清除率测定

参照Blois的方法[14]测定，略有变动。取质量浓度分别为3、6、12、24、48、96 mg/mL样品溶液100 μL，加入0.2 mmol/L DPPH溶液100 μL，充分混匀，避光静置30 min后，以甲醇为空白对照，抗坏血酸为阳性对照，于517 nm波长处测吸光度。每一样品平行测3次，取平均值。清除率公式表示为：

DPPH清除率=（1-D1/D2）×100%。

式中：D1为样品或者阳性对照吸光度;D2为空白对照吸光度。

1.2.6.2 ABTS自由基清除率测定

参照Re等的方法[15]测定。在反应体系中，样品溶液质量浓度亦分别为3、6、12、24、48、96 mg/mL，体积100 μL，以甲醇为空白对照，抗坏血酸为阳性对照。每一样品平行测3次取平均值。

上述所有試验于2017年7—11月在河南省科学院天然产物重点试验室完成。

2 结果与分析

2.1 单因素对金银花三萜提取率的影响

2.1.1 料液比

设定乙醇浓度60%、超声时间50 min、温度50 ℃，考察不同料液比（1 g ∶10 mL，1 g ∶15 mL，1 g ∶20 mL，1 g ∶25 mL，1 g ∶30 mL，1 g ∶35 mL）对金银花三萜提取率的影响，结果见图1-A。随溶剂体积的增加，提取率逐渐增大，1 g ∶30 mL达到最大，之后不再增加，因此选择较佳料液比为1 g ∶30 mL。

2.1.2 乙醇浓度

设定料液比1 g ∶30 mL、超声时间 50 min、温度50 ℃，考察不同乙醇浓度（20%、40%、60%、80%、100%）对金银花三萜提取率的影响，结果见图1-B。随着乙醇浓度增加，提取率增大，80%达到最大;之后提取率不升反降，可能由于金银花三萜极性与80%乙醇相似，选择80%乙醇为最佳提取浓度。

2.1.3 超声时间

设定料液比1 g ∶30 mL、乙醇浓度80%、温度50 ℃，考察不同超声时间（20、40、60、80、100 min）对金银花三萜提取率的影响，结果见图1-C。40 min时提取率陡然上升，此后逐渐下降，可能超声时间延长，使三萜化合物发生部分转化，故选择最佳提取时间为40 min。

2.1.4 超声温度

设定料液比1 g ∶30 mL、乙醇浓度80%、超声时间40 min，考察不同超声温度（30、40、50、60、70 ℃）对金银花三萜提取率的影响，结果见图1-D。40 ℃时提取率最高，超过此温度提取率下降，可能温度升高会影响三萜稳定性，故选择40 ℃为最佳提取温度。

2.2 响应面法优化金银花三萜提取工艺

2.2.1 不同因素对提取效果的影响

采用Design-Expert 8.0.6软件得到拟合模型：

y=3.693 00+0.154 08A-0.120 08B+0.073 417C+0.121 75D-0.100 25AB+7.500 00E-004AC+0.059 750AD-0.054 000BC-0.081 500BD-0.045 000CD-0.467 75A2-0.444 00B2-0.083 500C2-0.135 50D2。

对拟合模型进行方差分析，结果见表3。由表3可以看出，回归模型极显著（P<0.000 1），而误差项不显著，说明回归方程与实际情况吻合较好，试验误差小，因此可用该回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析。

决定系数R2和调整决定系数Adj R2分别为0.974 3和0.948 6，说明该模型拟合度良好;预测决定系数Pred R2为 0.873 7，说明该模型预测性良好。方程中A、B、C、D、A2、B2、D2对响应值影响极显著，料液比A、乙醇浓度B、提取温度D对提取率影响最显著，其次为超声时间C。AB交互作用显著，说明不同提取条件与金银花总三萜提取率之间不是简单的线性关系。

2.2.2 各因素交互作用分析

图2是采用Design-Expert 8.0.6软件绘出的响应面及等高线图。等高线的形状反映交互效应的强弱，圆形表示两因素交互作用不显著，而椭圆形则表示两因素交互作用显著。从响应面等高线的分布规律和间隔距离可以看出因素间交互作用的强弱和因素对响应值的影响程度[16]。图2表明料液比与乙醇浓度之间交互作用最显著，对金银花三萜的提取率影响最大。

2.2.3 最佳条件的确定及验证试验

用Design-Expert 806软件得出金银花总三萜提取最优条件为：料液比 1 g ∶31.1 mL，乙醇浓度75.4%，超声时间47.8 min，超声温度 45 ℃，为适应试验操作调整为：料液比1 g ∶30 mL，乙醇浓度75%，超声时间50 min，超声温度45 ℃。此条件下进行5次验证试验，平均提取率为3.71%，达到预测提取率（3.77%）的98.4%，说明应用响应面法优化了金银花总三萜的超声辅助提取工艺，且金银花中三萜类物质含量较高。

2.3 抑菌试验结果

金银花总三萜抑菌试验结果见表4。对所选7种常见致病菌的最小抑菌浓度（MIC）范围在3～24 mg/mL，整体抑菌作用较强，尤其是对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑制作用最强。

2.4 抗氧化试验结果

DPPH和ABTS自由基清除试验结果显示，金银花总三萜系列溶液浓度分别为3、6、12、24、48、96 mg/mL，对应的DPPH清除率分别为24.3%、36.8%、45.6、49.7%、53.2%、55.8%，对应的ABTS清除率分别为27.5%、39.6%、48.3%、51.3%、

59.7%、62.8%，表明金银花总三萜具有一定的清除自由基的能力，清除率50%即IC50所对应浓度分别为26.1 mg/mL和18.8 mg/mL，且清除能力随总三萜含量增加而增强，呈现出良好的剂量效应关系。

3 结论与讨论

中药功能活性成分复杂，其疗效多是由多成分、多靶点、多效应综合作用的结果，加之金银花总三萜含量、提取工艺及抗菌、抗氧化活性至今未见报道，因此，本试验选择总三萜作为金银花有效成分的提取指标。提取工艺的优劣能直接影响生药的利用率及后期加工的难易，提取工艺的研究是中药生产实现现代化的关键环节。

超声波提取法近年来迅速发展。超声波能增大物质分子运动频率和速度，增加溶剂穿透力，提高药物成分溶出速度和溶出数量，因此与常规方法比较，超声波法提取效果好、对有效成分破坏少[17]。提取料液比、提取温度、提取溶剂、提取时间等是影响药物有效成分提取率的关键因素，要得到最佳提取工艺须要进行大量的试验研究，响应面法是优化提取工艺时常采用的方法。

本研究应用响应面法优化金银花总三萜的超声辅助提取工艺，确定的最佳提取工艺参数为：料液比1 g ∶30 mL、乙醇浓度75%、超声时间50 min、超声温度45 ℃，此条件下得到三萜提取率为3.71%，与其他中药相比，金银花中总三萜含量较高，且表现出了较强的抗菌活性和一定的抗氧化活性，说明在产量及活性方面金银花三萜都具有进一步研究开发的价值;加之试验值与理论值大致相同，说明该工艺省时省力、科学性强，具有较强的实际应用价值。本研究为进一步研究金银花三萜化合物、提高金银花资源综合开发利用提供试验依据。

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