不同基因型玉米自交系拔节期与抽雄期干旱胁迫的生理响应机制

鲁晓民 张军 曹丽茹 张前进 魏昕 王振华 张新

摘要：为研究不同生长发育阶段中度干旱胁迫下不同基因型玉米自交系的生理响应机制，筛选抗旱种质资源，通过可控移动旱棚对拔节期和抽雄期9份玉米自交系进行中度干旱胁迫，测定相对含水量（RWC）、叶绿素（Chl）、类胡萝卜素（Car）、脯氨酸（Pro）含量及超氧化物歧化酶（SOD）、抗氧化物酶（POD）活性等生理指标的变化，采用热图和隶属函数平均值（AVG）分析不同基因型自交系各个生理指标的响应程度并进行抗旱性归类。结果表明，旱胁迫下，与对照相比，拔节期和抽雄期玉米自交系的叶片RWC、Chl和Car含量均有不同程度的下降，Pro含量及SOD、POD活性均不同程度的提高;在拔节期，郑6613、郑718、吉853、郑6722、郑7413、郑754归于抗旱型自交系，郑663归为中抗型自交系，B73和自交系DH351归为敏感型自交系;在抽雄期，郑6613、吉853、郑6722、自交系郑663归于抗旱型自交系，DH351、郑718、郑7413、郑754归为中抗型自交系，B73归为敏感型自交系。其中郑6613、吉853和郑6722在2个生育期均表现为较强的抗旱性，这些种质的应用对今后的抗旱育种及应对黄淮海高温干旱天气有着重要的现实意义。

关键词：玉米;中度干旱胁迫;生理指标;热图;平均隶属函数

中图分类号： S513.034  文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）16-0097-06

收稿日期：2018-05-04

基金项目：河南省农业科学院科研发展专项资金（编号：YNK201710603）;河南省重大科技专项（編号：151100111000-02）;河南省基础前沿项目（编号：162300410139）。

作者简介：鲁晓民（1980—），男，河南许昌人，博士，副研究员，主要从事玉米遗传育种研究。

通信作者：张 新，研究员，主要从事玉米遗传育种研究。

干旱是限制作物产量重要的非生物胁迫因素之一。玉米是高光喜水作物，整个生育期都需要大量的水分，对干旱比较敏感，尤其是苗期、拔节期、抽雄散粉期和灌浆期。近年来，黄淮海自然灾害天气频发，在玉米生长的关键时期经常出现长时间的高温干旱天气，并对玉米产量造成了严重的损失。研究表明，不同基因型玉米自交系对干旱胁迫的敏感程度不同，耐旱型的受旱胁迫影响较小，因此筛选鉴定耐旱种质并培育耐旱品种是解决干旱胁迫、降低产量损失的必然途径。

干旱胁迫影响植物的生理和生化过程，胁迫下作物正常的水分平衡被打破，水势降低，并导致水分代谢途径发生改变，进而影响作物的生长发育，最终产量降低或无产量;同时植物可通过诱导各种形态和生理反应来响应和适应干旱胁迫[1-3]。参与旱胁迫有多个过程，如渗透调节物和抗氧化酶、植物生长调节剂、胁迫蛋白和水通道蛋白、转录因子的积累和信号传导途径。

抗氧化反应是参与旱胁迫最终的反应之一，旱胁迫下作物体内包括叶绿体、线粒体、过氧化物酶体等都能产生大量的活性氧（ROS），从而对细胞造成严重的伤害，导致代谢紊乱[4]。为了应对ROS造成的伤害，作物通过自身的抗氧化机制来抵抗旱胁迫，如通过提高超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）等的活性，还有一些小分子抗氧化剂（如类胡萝卜素、多酚、花青素等）和一些渗透剂（如蛋白质和糖等）来清除过量的ROS[5-7]。

另外，旱胁迫下作物自身亦可通过合成不同的渗透剂，通过在缺水条件下维持细胞膨胀和其他的生理机制来保护细胞结构和功能以及保持水平衡并延迟脱水损伤，从而维持水分平衡，降低细胞渗透势被破坏的程度，并且渗透调节剂可以进一步改善作物生殖期的碳水化合物分配，并最终提高产量[8-9]。脯氨酸是一种强渗透调节物，旱胁迫下作物体内游离脯氨酸迅速成倍的积累，不仅有助于维持细胞膨胀，而且还参与猝灭自由基，维持亚细胞结构和缓冲细胞氧化还原电位[10]，显著提高作物的耐旱性。

本研究利用可控移动旱棚对9份国内玉米骨干系及自选系在拔节期和抽雄期进行中度旱胁迫，通过对自交系叶片RWC、SOD、POD、Pro、Chl和Car等生理指标的测定，利用热图分析不同基因型自交系的耐旱性及每个生理指标的响应程度;采用隶属函数平均值（AVG）进行不同基因型自交系抗旱性鉴定，以期筛选出在拔节期和抽雄期抗旱性强的自交系，为今后的玉米抗旱育种提供种质基础及理论指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料及种植方式

2017年在河南省农业科学院原阳基地可控移动旱棚内种植9份国内玉米骨干系及自选系（名称及编号见表1），每份材料种植1行，每行16株，行长4.0 m，行距0.6 m，株距 0.25 m。设对照和干旱（拔节期和抽雄期）3个处理，处理间设以3 m水分隔离带。对照土壤田间最大持水量持续保持在75%以上，拔节期和抽雄期前分别对干旱处理进行5 d的水量控制，保持田间最大持水量在40%左右，而后进行15 d的干旱胁迫。

1.2 试验方法

1.2.1 生理指标测定

拔节期取样部位为倒数第2叶，抽雄期取样部位为穗位叶，主要测定相对含水量（RWC）、叶绿素（Chl）、类胡萝卜素（Car）、 游离脯氨酸（Pro）含量及超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）活性。Chl和Car含量采用丙酮法测定[11];SOD活性采用氮蓝四唑法测定、POD活性采用愈创木酚法测定[12];RWC采用烘干法测定;Pro积累量采用磺基水杨酸提取-茚三酮法测定[13]。

1.2.2 抗旱性评价

抗旱系数=干旱胁迫下性状值/对照性状值。隶属函数值U（X）=（X-a1）/（a2-a1），式中：X为某一指标的抗旱系数;a1、a2分别为所有材料某一指标的最小和最大抗旱系数。根据抗旱隶属函数的平均值分为4级：U（X）≥0.7属于1级，强抗旱型;0.5≤U（X）<0.7属于2级，抗旱型;0.4≤U（X）<0.5属于3级，中抗旱型;0≤U（X）<0.4属于4级，弱抗旱型。

1.3 数据处理与分析

试验数据以3次重复的“平均值±标准偏差”表示，并利用SPSS 16.0统计软件进行方差分析，采用Duncans新复极差法进行差异显著性分析和多重比较，并使用SigmaPlot 12.5和R语言3.4软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 旱胁迫对拔节期和抽雄期不同基因型玉米自交系生理生化指标的影响

2.1.1 旱胁迫对拔节期和抽雄期不同基因型玉米自交系相对水含量（RWC）的影响

由图1可知，旱胁迫下，与正常水分条件相比，不同基因型玉米自交系在拔节期和抽雄期RWC显著或极显著下降，且不同生育期同一自交系和同一生育期不同自交系下降幅度不同。旱胁迫下，玉米体内自由水含量急剧下降，拔节期郑6613和抽雄期郑718、郑663自交系的RWC下降幅度达到显著水平，其他自交系在2个生育期均达到极显著水平，说明拔节期郑6613和抽雄期郑718、郑663在旱胁迫下体内自由水含量受影响较小，RWC相对较高。

2.1.2 旱胁迫对拔节期和抽雄期不同基因型玉米自交系脯氨酸（Pro）含量的影响

正常水分条件下，不同基因型玉米自交系在拔节期和抽雄期的Pro含量均较低，且抽雄期明显高于拔节期。由图2可知，旱胁迫下，不同基因型玉米自交系在不同生育期Pro积累量均增加，尤其是拔节期郑718、郑6722、郑663和抽雄期郑6613、郑6722等自交系Pro含量积累相对较多;除抽雄期DH351的Pro含量积累未达到显著水平、拔节期B73达到显著水平外，其余自交系均达到极显著水平。研究表明，不同基因型自交系在旱胁迫下均可通过积累游离Pro的含量来缓解旱胁迫的压力，但不同自交系及其在不同生育期时的Pro含量积累不尽相同。

2.1.3 旱胁迫对拔节期和抽雄期不同基因型玉米自交系叶绿素（Chl）含量的影响

正常水分条件下，不同基因型玉米自交系在拔节期和抽雄期的Chl含量相对较高，但存在一定的差异，可能与自交系的基因型有关。旱胁迫下，作物体内的叶绿素由于不稳定而降解，不但叶绿素含量下降，而且也损害了光合器官，光合作用下降[14]。从图3可以看出，旱胁迫下不同基因型玉米自交系在2个生育期的Chl含量均存在不同程度的下降，其中抽雄期胁迫与对照相比，除B73和郑718自交系在胁迫下未到达差异显著水平外，其他自交系在抽雄期下降程度均达到显著或极显著水平。

2.1.4 旱胁迫对拔节期和抽雄期不同基因型玉米自交系类胡萝卜素（Car）含量的影响

类胡萝卜素是一种辅助色素，可以吸收可见光来辅助叶绿素捕获光能。不同自交系自身所含Car含量不同，正常情况下，不同基因型自交系在2个生育期的Car含量略高，旱胁迫时，Car含量有所下降，但不同自交系、不同生育期下降的幅度不同，可能与基因型和生长发育阶段所需有关。由图4可知，与对照相比，旱胁迫下自交系均不同程度下降，但不同自交系下降幅度不同，拔节期的DH351、吉853、郑663和抽雄期的郑6613等自交系的Car含量下降甚少。

2.1.5 旱胁迫对拔节期和抽雄期不同基因型玉米自交系过氧化物酶（POD）活性的影响

POD作为抗氧化酶之一，能够清除ROS来维持植物正常生长，植物在遭受旱胁迫时可通过提高其活性来缓解旱压力，从而保护细胞膜免受伤害。正常条件下，不同基因型自交系在2个生育期的叶片POD活性较低，且不同生育期、不同自交系间也不相同。由图5可知，旱胁迫下不同生育期玉米自交系的POD活性均极显著提高，抽雄期不同玉米自交系POD活性升高幅度比拔节期的要高很多，推测玉米自交系在抽雄期旱胁迫下，POD在缓解干旱造成的胁迫方面起着重要的作用， 其中自交系吉853和郑7413表现得尤为明显。

2.1.6 旱胁迫对拔节期和抽雄期不同基因型玉米自交系超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响

应对干旱胁迫，1种抗氧化酶作用是有限的，SOD与POD一样是重要的抗氧化酶之一，二者在旱胁迫下协同作用，清除旱胁迫下的过量ROS，维持植物体内自由基平衡。正常水分情况下，不同基因型玉米自交系叶片SOD活性较低。由图6可知，旱胁迫下自交系SOD活性均明显上升，且不同生育期、不同自交系活性提高幅度不同，除抽雄期郑754自交系外，其他均达到显著甚至极显著水平。

2.2 旱胁迫下拔节期不同基因型玉米自交系的抗旱性綜合评价

以所测生理指标隶属函数值进行抗旱性热图分析。从图7可以看出，在拔节期旱胁迫下，自交系吉853和郑754抗旱性接近，与对照相比所有生理指标均响应旱胁迫压力，尤其是SOD、POD活性提高较大，脯氨酸积累较多，叶绿素含量、类胡萝卜素含量和RWC下降较少，抗旱性较强;自交系B73和DH351抗旱性接近，与对照相比，SOD、POD活性提高较小、脯氨酸积累较少，RWC较低，属于旱敏感型自交系。

从各生理指标的平均隶属函数值（表2）发现，自交系郑6613、郑718、吉853、郑6722、郑7413、郑754平均隶属函数值在0.556～0.686之间，属于抗旱型;自交系郑663平均隶属函数值为0.445，属于中抗型;自交系B73和DH351平均隶属函数值分别为0.399、0.330，属于旱敏感型，与热图所展示的结果基本一致。

2.3 旱胁迫下抽雄期不同基因型玉米自交系的抗旱性综合评价

从图8可以看出，在抽雄期旱胁迫下，自交系吉853与对照相比，SOD、POD活性提高较大，脯氨酸积累量较多，且抗氧化剂类胡萝卜素破坏较小，叶绿素含量和RWC下降较少，属于抗旱性较强;自交系B73与对照相比，叶绿素和类胡萝卜素破坏严重，含量较低，属于旱敏感型自交系。

从各生理指标的平均隶属函数值（表3）发现，自交系郑6613、吉853、郑6722、郑663平均隶属函数值在0.502～0.594 之间，属于抗旱型;自交系DH351、郑718、郑7413、郑754平均隶属函数值在0.406～0.496之间，属于中抗型，自交系B73平均隶属函数值为0.390，属于旱敏感型，与热图所展示的结果基本一致。

3 討论与结论

与其他环境胁迫一样，旱胁迫影响作物内的许多生理和代谢过程。轻度胁迫水平（-0.4 MPa）作物不受影响，但是中度和重度胁迫下严重影响作物生长发育。渗透调节一直被认为是耐旱性的重要部分，玉米通过不同渗透物质的积累来维持细胞膨压和保护细胞结构，以此来提高耐旱性，目前与渗透相关的耐旱生理指标有渗透势、可溶性糖和脯氨酸等[15]。Ghaderi等的研究发现，中度和重度旱胁迫影响作物体内脯氨酸的生物合成和积累及可溶性碳水化合物含量[16]。PEG诱导水分胁迫下，一些相容的溶质如脯氨酸和其他游离氨基酸的积累量显著增加以调节渗透压、维持pH值、保护细胞内大分子物质并且清除有害自由基[17]。强渗透调节剂脯氨酸在作物中可以稳定膜并在低叶水势下维持蛋白质的结构，不同作物及相同作物的不同品种间脯氨酸的合成和积累是不同的。有研究报道，脯氨酸通过清除或减少O2的产生而参与减少类囊体膜中的光损伤[18]。本研究旱胁迫下2个生育期的不同基因型自交系均不同程度的积累脯氨酸，尤其是拔节期郑718、郑6722、郑663和抽雄期的郑6613、郑6722自交系，脯氨酸积累较多，与前人抗旱性研究结果[19-21]基本一致。

叶绿素是一种光合色素，参与光吸收并在作物光合作用中起重要作用。干旱胁迫能够加速叶绿素的分解，因此叶绿素可作为鉴定作物旱胁迫严重程度的重要指标之一[22-24]。严重干旱下，当光合被抑制和光激发能量过量时，作物保持较低的叶绿素含量也许有助于减少作物光氧化损伤[25]。Chen等的研究表明，叶绿素含量与抗旱性呈显著负相关，叶绿素含量与干旱恢复显著正相关[24]。本研究中，旱胁迫下不同生育期不同基因型玉米自交系的叶绿素含量下降明显，多数自交系达到显著或极显著水平。

Guha等的研究表明，抗坏血酸、谷胱甘肽、多酚和类胡萝卜素可能是鉴定旱胁迫下作物抗旱性的重要指标[26]。酶类和非酶类抗氧化剂的高活性水平是提高耐旱性的重要因素之一。旱胁迫下，完善的抗氧化防御系统可以防护过氧化反应，保护植物生长发育，增强抗旱性，这些研究已经在大米[27]、甘蔗[28]和小麦[29]中得以证实。

作物含有大量的类胡萝卜素，可以作为活性氧的非酶清除剂[30-31]，主要是清除作物内的单线态氧，类胡萝卜素主要与光合作用中心相关，因此其损伤是可以被检测到的。Chandrasekar等的研究表明，含有较高类胡萝卜素的基因型作物抗旱性较强[19]。Chen等对玉米自交系主成分分析表明，旱胁迫下类胡萝卜素占很大权重，旱胁迫及复水后类胡萝卜素与相对含水量RWC表现一致，与抗旱性呈显著正相关[24]。本研究旱胁迫下，拔节期自交系吉853、郑6722、郑754和抽雄期自交系郑6722均保持较高的类胡萝卜素含量，并被鉴定属于抗旱型自交系。

鲁晓民等的研究报道，玉米自交系提高抗氧化酶活性来消除ROS与抗旱性相关[20-21]。本研究干旱胁迫下，拔节期和抽雄期不同基因型的玉米自交系叶片中的抗氧化防御系统酶活性（SOD和POD）均显著或极显著提高，但不同生育期、不同基因型自交系的活性提高不同，推测是由不同生长发育阶段和基因型差异引起的。

通过热图来展现旱胁迫下各生理指标在不同时期不同自交系中所起的作用程度及直观地鉴定自交系抗旱性，这种形式在抗旱研究中还不多见。本研究利用热图和平均隶属函数来对玉米自交系的抗旱性进行综合性评价，清晰、直观地将不同基因型玉米自交系的抗旱性进行了归类。在拔节期，郑6613、郑718、吉853、郑6722、郑7413、郑754归为抗旱型自交系，郑663归为中抗型自交系，B73和自交系DH351归为旱敏感型自交系;在抽雄期，郑6613、吉853、郑6722、郑663归为抗旱型自交系，DH351、郑718、郑7413、郑754归为中抗型自交系，B73归为旱敏感型自交系，热图和平均隶属函数展示的归类结果也基本一致。其中郑6613、吉853和郑6722自交系在拔节期和抽雄期均属于抗旱类型，这些种质的应用对于今后培育抗旱性玉米新品种，解决黄淮海高温干旱带来的玉米产量损失有着重要的现实意义。

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