中草药对森林脑炎小鼠脑中TLR/TRIF通路基因表达的影响

张瑜

(黑龙江中医药大学临床医学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

随着近年来地球气候变暖森林脑炎在有不断扩大流行的趋势，目前，森林脑炎的治疗药物主要有地塞米松、利巴韦林和干扰素等，这些药物虽都有抗菌消炎的作用，但如果长期、大剂量应用，则会引起各种不良反应和停药反应[1]。有研究表明，复方中药对森林脑炎具有良好的治疗效果，但其治疗机制还不明确[2]。因此，本实验依据我国传统医学临床经验和现代医学研究成果，选择苦参、诃子、川楝子、栀子、紫花地丁等中药组方对感染森林脑炎病毒的小鼠进行治疗，对其脑组织中炎性因子的含量进行测定，并对脑组织中介导炎性反应的TLR/TRIF信号通路中相关基因的表达进行分析，对复方中药是如何降低炎症损伤，发挥其对脑组织的保护作用的途径和机制进行探讨。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 病毒液的制作和收集

将森林脑炎病毒液加入地鼠肾传代细胞培养瓶中，加入病毒液后慢慢晃动混匀，保证病毒液充分接触并感染细胞后，将培养瓶37℃培养90 min。每天观察细胞，当超过90%细胞病变并有细胞脱落时收获细胞病毒液，然后反复在-80℃、-37℃条件下反复冻融细胞，充分释放病毒于细胞培养液中，无菌条件下1 000 rpm，离心10 min，收集上清液，分装备用。

1.1.2 感染小鼠模型的制作

选取清洁级21日龄雄性小鼠，体质量(18±1)g，制作模型前禁食12 h，禁水6 h。将小鼠麻醉后，在小鼠眼后角、耳前缘、颅中线所构成的三角形中点部位，将微量注射器抽取好的病毒悬液20 μL垂直进针3～5 mm，将病毒液缓慢推进鼠脑，注毒结束后待病毒液完全吸收后再快速将针头拔出，以免未被脑组织完全吸收的病毒液流出。采用RT-PCR技术检测实验小鼠血清中森林脑炎病毒的RNA片段，以鉴定动物模型制作的成功。

1.1.3 复合中药

复合中药由苦参、诃子、川楝子、栀子、紫花地丁等5味药材饮片由黑龙江省中医药大学提供，经50℃烘干、粉碎后过40目筛制成原粉。苦参、诃子、川楝子、栀子、紫花地丁原粉按4∶2∶2∶2∶1的比例组方，加水煎煮2次，每次煎煮90 min，取过滤后药汁混合，浓缩药汁,使1 mL的药液相当于1 g的药粉，以浓缩药汁为实验药液。

1.2 实验设计与分组

选取12只健康小鼠作为空白组，另选取48只模型小鼠随机分为模型组、中药高剂量组、中药中剂量组、中药低剂量组、每组各12只。各组具体处理方法如下,空白组：动物正常饲养，颅内注入与病毒液等量的生理盐水,观察期内予与中药药液等量的蒸馏水灌胃；模型组：动物接受森林脑炎病毒感染脑组织模型的制备，观察期内予与中药药液等量的蒸馏水灌胃；高剂量组：动物接受森林脑炎病毒感染脑组织模型的制备12 h后按1.56 g/kg剂量给予灌胃治疗，每日2次；中剂量组：动物接受森林脑炎病毒感染脑组织模型的制备12 h后按0.78 g/kg剂量给予灌胃治疗，每日2次；低剂量组：动物接受森林脑炎病毒感染脑组织模型的制备12 h后按0.39 g/kg剂量给予灌胃治疗，每日2次。动物饲养于人工控制条件下，小鼠同室、分笼饲养，每笼6只。室温控制在20～23℃，相对湿度为50%～60%，每12 h光照/黑暗循环，小鼠可自由进食、进水，保持垫料清洁干燥，实验期为7 d。

1.3 检测指标与方法

实验第4 d和7 d，每组选择5只小鼠麻醉后，断头取脑，剥离脑组织，取右侧大脑半球置入冻存管中并迅速投入-80℃冰箱备存，其中一半用于组织匀浆采用ELISA方法检测脑组织中TLR-2、IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子含量，另一半提取总RNA用于荧光定量PCR检测大鼠脑组织TLR-2、TRIF、NF-κB、MyD88和TRAF6等基因的表达，实验方法按试剂盒说明书操作进行。

1.4 统计学处理

2 结果与分析

2.1 复方中药对小鼠脑组织中炎性因子含量的影响

小鼠脑组织中炎性因子的检测结果见表1。在实验第4 d和7 d，模型组和各治疗组小鼠脑组织中的TLR-2含量显著高于空白组(P<0.05)；在实验第4 d和7 d，模型组、低剂量组小鼠脑组织中的TLR-2含量显著高于中、高剂量组(P<0.05)。

表1 复方中药对小鼠脑组织中炎性因子含量的影响

注：与空白组同时间点比较，*P<0.05；与模型组同时间点比较，△P<0.05

在实验第4 d和7 d，模型组和各治疗组小鼠脑组织中的IL-1β、IL-6、TNF-α含量显著高于空白组(P<0.05)；在实验第4 d和7 d，模型组、低剂量组小鼠脑组织中的IL-1β、IL-6、TNF-α含量显著高于中、高剂量组(P<0.05)。

2.2 复方中药对小鼠脑组织TRIF/NF-κB信号通路基因表达的影响

复方中药对小鼠脑组织TRIF/NF-κB信号通路基因表达的影响见表2。在实验第4 d和7 d，模型组和各治疗组小鼠脑组织中的TLR-2基因表达量显著高于空白组(P<0.05)；在实验第4 d和7 d，模型组、低剂量组小鼠脑组织中的TLR-2基因表达量显著高于中、高剂量组(P<0.05)。

在实验第4 d和7 d，模型组和各治疗组小鼠脑组织中TRIF、NF-κB、MyD88和TRAF6基因表达量显著高于空白组(P<0.05)；在实验第4 d和7 d，模型组、低剂量组小鼠脑组织中TRIF和NF-κB基因表达量显著高于中、高剂量组(P<0.05)。

3 讨论

森林脑炎病毒感染脑组织后所引起的神经损伤是由多种不同因素共同参与的，其病理过程极其复杂。近年来，对急性免疫所介导的炎症反应对脑组织造成的继发性损伤越来越受到临床研究重视。有研究指出，脑在感染病毒后会引起组织的中性粒细胞的渗出、浸润，进而释放出不同类型的炎性细胞因子，同时也会引起脑组织中微血管循环的阻塞，从而造成病灶局部的脑缺血。有研究证明，患有脑炎的幼儿的脑脊液中，IL-6会出现过度高表达的现象，导致患者出现细胞毒性脑水肿，并伴随神经细胞的损伤，而且这种IL-6高表达与神经功能缺损程度呈正相关。研究还发现，脑中的IL-6可以通过激活补体系统对脑细胞造成损害，而且补体系统被激活后，还会产生大量过敏毒素并进一步刺激TNF-α的分泌，从而激活并增加脑细胞中黏附分子的表达，并释放相关的蛋白酶和氧化酶，导致脑组织的继发性损害的加剧[3]。有研究表明， IL-1β、IL-6等炎性因子会先后释放到动物的脑组织中，而这些炎性因子会对血脑屏障造成破坏，增强血脑屏障的通透性，从而介导了脑组织发生急性免疫的炎症损伤，加重脑组织的损害，并进一步加重神经细胞的变性、坏死情况；而减弱IL-1β、IL-6等炎性细胞因子的活性，动物脑组织的损伤程度也随之减轻[4]。研究表明，TNF-α等炎性因子通过增强脑组织内皮细胞中NO的毒性来对血脑屏障进行破坏，动物感染病毒性脑炎后，TNF-α可以通过激活信号通路引发神经细胞、内皮细胞甚至胶质细胞的凋亡，而且TNF-α的大量分泌引起的钙超载和自由基的过量产生也可以诱导细胞的凋亡[5]。在本实验中，经过中、高剂量治疗后，感染森林脑炎病毒的小鼠脑组织中的炎性因子含量显著降低，说明复方中药可以有效降低感染小鼠脑组织的炎性反应，减轻脑组织损伤。

表2 复方中药对小鼠脑组织TRIF/NF-κB信号通路基因表达的影响

注：与空白组同时间点比较，*P<0.05；与模型组同时间点比较，△P<0.05

目前，Toll样受体(TLR)家族被认为是哺乳动物体内唯一能够识别细胞外抗原信息，并将该信息向细胞内传递，从而引发炎症级联反应的关键跨膜蛋白家族。TLR家族的其他功能还包括调节免疫应答，促进免疫细胞表达相关免疫分子等。TLR-2是模式识别受体中的一种，主要分布在细胞表面，可以识别病毒病原相关分子模式(PAMPs)，在病毒入侵机体的早期即启动固有免疫，其主要作用是促进细胞炎性因子的产生[6]。TLR-2特异性识别病毒PAMPs结构后，促使相关激活细胞信号转导途径，并进一步介导多种快速反应基因的活化，表达炎症细胞因子、趋化因子和共刺激分子免疫细胞因子等，参与机体对抗原的防御反应，诱导炎症反应。TLR-2的信号传导包括两条途径：即髓样分化因子(MyD88)的依赖和非依赖途径，MyD88途径被认为是TLR-2信号传导的主要通路。TLR-2识别配体后，主要通过TRIF途径活化NF-κB等诱导炎症细胞释放炎性因子并介导机体发生炎症反应，对病毒产生天然免疫。因此，NF-κB是重要的炎症调控因子，它通过诱导激酶激活IκB家族中的α、β激酶，使IκB磷酸化降解。NF-κB除了调控多种炎症因子外，还是一种能够将细胞核内外信息双向传递的的多向性转录因子。该功能使NF-κB 被激活后能够进入核内进一步调控TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10等多种炎症因子的靶基因转录。因此，正常细胞中只需要有少量的NF-κB表达，而如果细胞过量NF-κB表达会给机体组织造成损伤[7]。研究证实，NF-κB 可以诱导多种神经毒性物质表达以及神经细胞凋亡，尤其在病毒性脑炎的脑组织继发性损害中起重要作用[8]。研究发现，TLR-2活化后能诱导细胞损伤, 活化的TLR-2可以通过内源性和外源性两条途径诱导细胞的凋亡，并破坏体内的血管屏障引起病毒扩散，从而加速疾病的恶化进程[9]。临床研究表明，TLR-2是森林脑炎病毒感染并加重中枢神经系统损伤的危险因素之一，森林脑炎病毒可引起动物脑组织中NF-kB蛋白水平和mRNA水平显著的升高，这一变化加重了脑炎的炎症反应，会对预后产生不利影响[10]。由此可见，在感染森林脑炎病毒后，动物脑组织细胞中的TLR/TRIF信号通路是重要的炎性介导途径，该信号通路通过激活下游炎症信号使下游炎性因子过度表达，诱发级联式炎症反应，加重森林脑炎向不良方向转变[10]。本实验荧光定量 PCR结果显示，虽然经过治疗后，感染森林脑炎病毒小鼠TLR-2、TRIF、NF-κB、MyD88和TRAF6依然要显著高于空白组，但是中、高剂量的药物治疗组显著低于对照组，再结合中、高剂量组小鼠脑组织中的炎性因子也显著低于模型组，说明复方中药可以通过抑制TLR/TRIF信号通路蛋白的表达，进而抑制感染森林脑炎病毒小鼠的炎症反应。

4 结论

综上所述，通过本实验研究发现，复方中药可以通过降低TLR/TRIF信号通路上TLR-2的表达，进一步抑制该通路下游的TRIF、NF-κB、MyD88和TRAF6蛋白的表达，从而抑制森林脑炎病毒感染小鼠脑组织中TLR-2诱导的炎性级联反应，降低森林脑炎病毒感染引起的脑组织急性免疫介导的炎症损害，保护脑组织不会受到炎症反应继发性损伤，为临床治疗森林脑炎提供了新的、有效的治疗手段。