Cry2Ab 蛋白对龟纹瓢虫的安全性研究

李亚荣， 张 帅， 雒珺瑜， 朱香镇， 王 丽， 崔金杰

中国农业科学院棉花研究所/棉花生物学国家重点实验室，河南 安阳455000

据报道，截至2017 年，24 个国家转基因作物种植面积已达到1.898 亿hm2(国际农业生物技术应用服务组织，2018)。 我国转基因棉花的成功培育和商业化种植促进了转基因抗虫水稻、玉米等作物的发展。 转基因作物的发展，在节约土地面积、解决我国部分地区的粮食短缺问题、减少农药污染方面创造了巨大的社会以及经济效益(高欣欣等，2018； 郭三堆等，2015)。 然而，与其他技术一样，转基因作物对环境的安全性也引起了人们的关注(范俊韬和李俊生，2007； 郭建英等，2008； 马祥建和郝德荣，2011； 吴启佳等，2016)。 转基因作物的大规模种植可能会对人类健康和生态环境造成影响。 因此，任何转基因作物进行商业化种植之前都必须经过严格的环境风险评价(路献勇等，2017)。转基因抗虫作物对农田重要非靶标生物的影响是生态环境风险评价的重要内容(杨艳等，2014)，其中，对非靶标生物尤其是在生态系统中扮演着重要角色的天敌昆虫的影响更应该倍加重视(高欣欣等，2018)。

龟纹瓢虫Propylea japonica(Thunberg)属鞘翅目瓢虫科龟纹瓢虫属，具有耐高温和捕食能力强等特点，是农田捕食性天敌的优势类群，可捕食棉蚜、飞虱、棉铃虫等多种害虫，被认为是转基因棉田的重要非靶标指示性天敌昆虫(郭传斌，2017； 刘艳敏，2016； 杨燕芳，2013)。

已有研究表明，Bt 蛋白对龟纹瓢虫解毒相关基因表达量、解毒酶活性、消化酶活性和肠道微生物没有不利影响(雒珺瑜等，2015； 王英丽，2014； 赵耀，2016)，而关于Bt 蛋白对非靶标生物体内游离氨基酸的影响目前还未见报道。 鉴于此，本研究以龟纹瓢虫为实验材料，研究Cry2Ab 蛋白对龟纹瓢虫不同龄期的发育历期、新羽化成虫的体重、雌雄比例及体内氨基酸种类和数量的影响，重点研究龟纹瓢虫取食不同浓度的Bt 蛋白后体内游离氨基酸的种类和含量的变化，以期为转基因棉花的环境安全评价积累科学数据，为转基因生物的安全管理提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫及饲养方法

龟纹瓢虫采自中国农业科学院棉花研究所东场实验基地，饲养于养虫笼(50 cm×50 cm×50 cm)，室内连续饲养5 代后备用。 饲养条件：光照L/D=14 h/10 h，温度(25±1)℃，湿度70%±10%；豌豆蚜为实验室扩繁多年的种群，以蚕豆为寄主，在培养箱内扩繁，扩繁条件：光照L/D=14 h/10 h，温度(20±1)℃，湿度70%±10%。

1.2 供试化合物

0.005 、0.05、0.5 mg·mL-1Cry2Ab 蛋白(中国农业科学院植物保护研究所植保生物技术研究室)；0.5 mg·mL-1E-64 蛋白酶抑制剂(美国Sigma 公司)；2 mol·L-1蔗糖(索莱宝科技有限公司)。 E-64蛋白酶抑制剂和Cry2Ab 蛋白均以2 mol·L-1蔗糖溶液为溶质进行配制。

1.3 Cry2Ab 蛋白对龟纹瓢虫生物学的影响

收集龟纹瓢虫卵块置于培养皿中，在培养箱光照L/D=14 h/10 h、温度(25±1)℃、湿度70%±10%条件下孵化，然后将幼虫挑至1.5 mL 离心管单管饲养。 用足量豌豆蚜饲喂龟纹瓢虫，龟纹瓢虫幼虫共有4 个龄期，在每个龄期蜕皮后，用2.5 μL 移液枪吸取0.5 mg·mL-1的Cry2Ab 蛋白1.0 μL 至1.5 mL 离心管壁上，饲喂处理24 h，以2 mol·L-1蔗糖溶液作为阴性对照；以0.5 mg·mL-1E-64 溶液作为阳性对照。 分别记录不同处理条件下龟纹瓢虫不同龄期的发育历期、羽化后12 h 内成虫的体重及性别比例。 每个处理设置30 头幼虫，3 个平行重复。

1.4 Cry2Ab 蛋白对龟纹瓢虫体内氨基酸种类和含量的影响

收集龟纹瓢虫卵块置于培养皿中，在培养箱光照L/D=14 h/10 h、温度(25±1)℃、湿度70%±10%条件下孵化，然后将幼虫挑至1.5 mL 离心管单管饲养，用足量豌豆蚜饲喂龟纹瓢虫初孵幼虫至3龄。 用2.5 μL 移液枪分别吸取0.005 和0.05 mg·mL-1的Cry2Ab 蛋白1.5 μL 至1.5 mL 离心管壁上，饲喂处理72 h(每个处理设置30 头幼虫，5 个重复)，以2 mol·L-1蔗糖溶液作为空白对照。 收取上述样品，测定龟纹瓢虫3 龄幼虫体内氨基酸的种类和含量。

游离氨基酸测定： 分别称取0. 005、 0.05 mg·mL-1Cry2Ab 蛋白处理和2 mol·mL-1蔗糖溶液处理的样品0.1 g，在液氮低温环境中充分研磨；研磨充分后加入2 mL 0.01 mol·L-1的盐酸，静置30 min 后摇匀浸提样品，然后在12000 r·min-1、4℃条件下离心10 min；准确吸取1.5 mL 上清液于离心管中，加入1.5 mL 8%的磺基水杨酸，充分混匀，静置15 min；取上清液，通过0.45 μm 的微孔滤膜过滤后上机检测氨基酸种类和含量。 氨基酸分析采用S-433D 型全自动氨基酸分析仪(德国赛卡姆公司)。

1.5 数据分析方法

用SPSS 18.0 软件对数据进行方差处理和分析，采用单因素方差分析和Duncan′s 差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 Cry2Ab 蛋白对龟纹瓢虫生物学的影响

2.1.1 Cry2Ab 蛋白对龟纹瓢虫发育历期的影响

由表1 可知，E-64 蛋白酶抑制剂处理后，龟纹瓢虫2、3、4 龄，预蛹以及蛹的羽化历期与Cry2Ab 蛋白处理和蔗糖对照处理相比均明显延长，说明本实验处理方法有效。 与蔗糖对照组相比，取食Cry2Ab 蛋白后龟纹瓢虫幼虫的2、3、4 龄的发育历期及预蛹和蛹期均没有显著性差异。 可见，Cry2Ab 蛋白对龟纹瓢虫幼虫的发育历期和化蛹及蛹的历期均没有显著影响。

2.1.2 Cry2Ab 蛋白对龟纹瓢虫成虫体重的影响

Cry2Ab 蛋白处理组的雌虫平均体重为7.37 mg，雄虫平均体重为5.99 mg，蔗糖组雌虫平均体重为7.56 mg，雄虫平均体重为6.19 mg，不同处理对雌雄成虫体重影响不大，且雄虫体重均低于雌虫。 说明Cry2Ab 蛋白处理对龟纹瓢虫雌雄体重没有影响。

2.1.3 Cry2Ab 蛋白对龟纹瓢虫雌雄比例的影响

Cry2Ab 蛋白处理组和蔗糖对照组的雌、雄虫比例相近。 Cry2Ab 蛋白处理组中龟纹瓢虫的雌虫比例为20%，雄虫比例为80%；蔗糖对照组中雌虫比例为23%，雄虫比例为77%，雌、雄虫比例之间差异未达显著水平。 说明Cry2Ab 蛋白对龟纹瓢虫成虫的雌雄性比无明显影响。

表1 Cry2Ab 蛋白对龟纹瓢虫发育历期的影响Table 1 Effect of Cry2Ab protein on the developmental duration of P. japonica

2.2 Cry2Ab 蛋白对龟纹瓢虫体内氨基酸种类和含量的影响

取食不同浓度Cry2Ab 蛋白的龟纹瓢虫幼虫体内主要氨基酸种类与蔗糖对照组相同，均为缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸；不同处理条件下，龟纹瓢虫幼虫体内8 种主要游离氨基酸含量最高的是赖氨酸，组氨酸次之，蛋氨酸含量最低，且Cry2Ab 蛋白处理组与蔗糖对照组相比无显著差异。 可见，Cry2Ab 蛋白对龟纹瓢虫幼虫体内主要氨基酸种类及含量无显著影响，即对幼虫体内代谢没有显著影响(表2)。

表2 Cry2Ab 蛋白对龟纹瓢虫体内氨基酸种类和含量的影响Table 2 Effect of Cry2Ab protein on amino acid composition and content in P. japonica

3 结论与讨论

转基因作物的推广和转基因技术的成熟加速了转基因作物在全球的商业化种植，随之而来的潜在的环境安全问题也引起了人们的关注。 转基因作物对非靶标昆虫的影响是潜在环境安全问题关注的焦点之一(周霞等，2018)。 转基因作物表达的目的蛋白可以通过食物链从植物传递给天敌，从而使天敌暴露于转基因作物所表达的蛋白环境中(高欣欣等，2018)。 对非靶标昆虫的影响是转基因作物环境安全评价的重要内容(Ramirez-Romero et al.，2008)。

已经有研究从不同方面评估了Bt 蛋白对非靶标性昆虫没有显著影响。 有研究表明转基因棉田里的节肢动物群落昆虫结构和组成，生物多样性等与非转基因棉田无显著性差异(雒珺瑜等，2016)；Chen et al.(2015)研究表明，Bt 水稻上褐飞虱卵对绿盲蝽Apolygus lucorμm (Meyer-Dür.)的生存能力(成虫羽化率和卵孵化率)、发育期(卵期，若虫发育期)、成虫鲜重、成虫寿命和繁殖力没有显著影响。 Yang et al.(2017)研究显示Bt 蛋白对非靶标昆虫蜘蛛的种群密度、捕食能力、相对丰度没有负面影响。

转基因作物对捕食性天敌影响的研究具有非常重要的经济学和生物学意义，在害虫综合防治中也具有重要地位(李丽莉，2004)。 大量试验研究了Bt 蛋白对非靶标捕食性天敌的影响。 研究表明，中华通草蛉Chrysoperla sinica (Tjeder)取食含Cry1Ab蛋白的饲料后幼虫的发育历期、结茧率、茧期、羽化率、成虫体重等生物学参数与取食不含Cry1Ab 蛋白的饲料处理相比均没有显著差异(高欣欣，2017)。 Ali et al. (2017a) 通 过 分 析 Cry1Ac、Cry2Ab、Cry1Ca、Cry1F 蛋白对异色瓢虫Harmonia axyridis (Pallas)化蛹率、羽化率、7 d 幼虫重量、性比和体重的影响来评估转基因作物对环境的风险。研究发现，含Cry1Fa 的转基因作物对草蛉没有不利影响(Ali et al.，2017b)。 以食物链为切入点的研究发现蚜虫不受Cry 蛋白的影响，从而消除了猎物质量对天敌寄生蜂等的影响(Tian et al.，2015)。 有研究发现带有Bt 蛋白的烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)被龟纹瓢虫取食后，其生长发育和捕食量没有明显变化(顾爱祥，2012)。 龟纹瓢虫取食含Bt 的水稻花粉后，其幼虫、蛹的生长发育和成虫生殖参数与取食非转基因水稻花粉的相比无显著差异(白耀宇，2004)。 张小洁(2014)研究表明，转Cry2A 和Cry1C 基因的水稻对龟纹瓢虫的生长发育不会产生负面影响。 目前，大多数的研究表明，转基因抗虫作物对非靶标昆虫，特别是对有益昆虫如捕食性天敌没有明显的不利影响(李丽莉等，2004)。 这些结论和本研究结果一致，龟纹瓢虫取食Cry2Ab 蛋白后其发育历期、成虫体重，雌、雄虫比例与对照组相比均没有显著变化。

蛋白质是细胞的主要组成成分和构成机体组织、器官的重要组成部分。 构成蛋白质的基本单位是氨基酸，组织中的游离氨基酸可以直接参与机体蛋白质合成和氨基酸代谢。 本研究以体内游离氨基酸为切入点，发现取食不同浓度的Cry2Ab 蛋白后龟纹瓢虫幼虫体内主要氨基酸种类与蔗糖对照组相同，均为缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸；与对照组相比，龟纹瓢虫幼虫体内8 种主要游离氨基酸的含量也没有明显差异。 可见，Cry2Ab 蛋白对龟纹瓢虫体内主要氨基酸种类及含量无显著影响。

随着转基因技术的深入和不断发展，转基因作物的研发力度和商业化种植的规模将逐渐扩大。一种新型转基因作物在商业化种植之前必须进行安全评价工作，特别是对非靶标天敌的影响。 本研究以非靶标天敌昆虫龟纹瓢虫为研究对象，从发育历期、成虫体重，雌、雄虫比例、游离氨基酸种类和含量的变化说明了Cry2Ab 蛋白对其生物学特性和氨基酸代谢没有显著影响。 本研究结果可为转基因作物的商业种植和推广提供参考依据。