2014—2018 年猪流行性腹泻病毒N 基因遗传变化分析

邢广旭，焦文强，刘运超，王治方，王克领，徐引弟，李海利，张改平

（1.河南省农业科学院动物免疫学重点实验室，河南郑州450002；2.河南省农业科学院畜牧兽医研究所，河南郑州450002；3.河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室，河南郑州450002）

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）感染猪引起的一种高度接触性肠道传染性疾病，临床主要表现为呕吐、水样腹泻，最后脱水死亡。该病可感染各年龄阶段的猪，7 日龄尤其是3 日龄以内的哺乳仔猪发病后死亡率最高可达100%[1]。该病在1971 年由英国首次报道[2]，并且迅速传播到欧洲其他国家，并在比利时流行期间被证实其病原为PEDV，给欧洲的养猪业带来了重大损失[3]。亚洲的日本、韩国、泰国等国家都曾先后报道过PED 的流行[4-8]。我国学者宣华等[9]于1984 年首次报道PEDV 在我国猪场的存在，并且在2010 年以前主要是以散发为主。但是从2010 年10 月开始，我国南部多省份暴发了仔猪严重腹泻，并迅速蔓延到全国多个省份和地区，测序结果证明，PED暴发是由变异的PEDV 引起[10-12]；2013 年5 月，美国暴发了PED 疫情，并很快蔓延到美国全国，其分离株与我国安徽分离株（AH20122）亲缘关系最为接近，表明PEDV 突变重组现象非常严重，同时这也是现有疫苗难以提供免疫保护的主要原因[13]。

PEDV 属于冠状病毒科（Coronaviridae）冠状病毒属（Coronavirus），核酸类型为单股正链RNA[14]。基因 组 由5′非 编码 区（untranslated region，UTR）、3'UTR 以及7 个开放阅读框（open reading frames，ORFs），分别编码3 个非结构蛋白（non-structural proteins，NSPs）和4 个结构蛋白（structural proteins，SPs）组成，也就是S 蛋白、E 蛋白、M 蛋白和N 蛋白[15]。其中，N 蛋白是所有结构蛋白质中含量最多的蛋白，在PEDV 感染早期机体会产生大量针对N 蛋白的抗体，因此，N 蛋白被用于早期诊断[16]。N 蛋白在宿主细胞内诱导产生细胞免疫过程中扮演着非常重要的角色[17]。此外，N 基因参与病毒基因组的转录、病毒核衣壳的形成以及病毒RNA 的包装[18-19]。

为深入了解PEDV 在我国遗传变异的情况，本研究对2014 年10 月至2018 年3 月采集到的205 份PEDV 疑似病料进行RT-PCR 检测，扩增阳性样品的N 基因序列并进行测序，旨在为指导临床PEDV的防控工作提供参考。

1 材料和方法

1.1 病料采集

本研究于2014 年10 月至2018 年3 月共采集来自河南、河北、山东、山西等地区疑似PEDV 病料205 份，包括仔猪小肠组织、粪便以及母猪血液等。

1.2 主要试剂

Taq DNA聚合酶、鼠源反转录酶（M-MLV）、RNA酶抑制剂、pMD18-T Simple 载体、DL2000 Marker RNA 提取试剂盒，均购自大连宝生物工程有限公司；琼脂糖购自Oxoid 公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 引物设计

参考GenBank 中收录的PEDV 毒株N 基因序列，使用Primer Premier 5.0 软件设计引物，上游引物为：5′-TACGGATCCATGGCTTCTGTCAGC-3′，下游引物为：5′-TCGCTCGAGTTAATTTCCTGTATC-3′，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 PEDV 的N 基因的克隆与测序

按照宝生物RNA 提取试剂盒操作说明书完成疑似样品的RNA 提取，随即合成cDNA，反应体系为：5×NLV 反转录缓冲液2 μL，dNTP 2 μL，MLV 反转录酶0.5 μL，rNAse 抑制剂0.3 μL，总RNA4.9 μL，充分混匀后置离心机瞬时离心混匀，42 ℃1.5 h，70 ℃10 min。以cDNA 为模板进行PCR 扩增，PCR反应体系为：Taq DNA 聚合酶1 μL，cDNA 1 μL，上下 游 引 物 各1 μL，dNTP 4 μL，10×PCR Buffer（Mg2+plus）5 μL，无菌双蒸水补足50 μL。反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃30 s，57 ℃30 s，72 ℃1 min，35 个循环；最后72 ℃延伸10 min。扩增结束后取5 μL PCR 产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，回收与预期大小一致的PCR 产物，并与pMD18-T simple 载体连接，4 ℃过夜后转化至JM109 感受态细胞，蓝白斑筛选后挑取单克隆进行培养，并提取质粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

1.5 数据处理

使用MEGA 5.0 软件构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 PEDV 的N 基因的扩增

205 份待检样品中，有191 份样品检测为PEDV 阳性，阳性率高达93.17%。从图1 可以看出，PCR 扩增PEDV N 基因的引物可以扩增出1 326 bp大小的片段，片段符合预期大小。

2.2 PEDV 的N 基因比对结果

本研究得到的19 株N 基因序列与国内外参考毒株进行比对，发现这19 株N 基因序列与国内外代表毒株相比，其核苷酸的同源性为94.8%～99.5%（图2），氨基酸的同源性为95.0%～99.3%（图3）。

2.3 PEDV 的N 基因的进化分析

使用MEGA 5.0 软件，将本研究得到的19 株PEDV 的N 基因序列与GenBank 中下载的序列构建系统进化树（图4）。从图4 可以看出，本研究得到的19 株PEDV 的N 基因序列与CV777、LZC、SM98、CH-S 和DR13 等毒株不在同一个分支上，表明这19 株N 基因序列与传统经典毒株进化关系较远；而CH-HENWZ-2015、CH-HENPY-2014、CH-HENZMDPY-2017 3 株序列形成一个分支，为G2b 亚群；其余16 株N 基因序列形成另外一个分支，为G2a亚群。表明N 基因进化趋势日益复杂，需要加强此方面的监控。

3 结论与讨论

通过RT-PCR 方法，本研究得到了19 株PEDV 的N 基因序列，与先前的报道一致。本研究得到的PEDV 的N 基因由1 326 个核苷酸组成，共编码441 个氨基酸，分子量为56 ku 左右，没有任何碱基的缺失和插入。有研究显示，PEDV 基因组有4 个超变区[20]，其中，V4 位于N 蛋白内，这与以前的结论不一致[21]。

本研究得到的19 株PEDV 的N 基因序列与GenBank 中下载的参考序列核苷酸的同源性为94.8%～99.5%，氨基酸的同源性为95.0%～99.3%。考虑到本研究所采集的样品来自河南、河北、山西、山东、湖北、甘肃、江西、上海等多个省市，并且本研究所采集的样品一共205 份，样本数量足够大，而且检测出191 份PEDV 阳性样品，所以，不管是样品的采集数量还是样品的覆盖面积，均具有较强的说服力，证明N 基因是PEDV 基因组中很保守的一个结构蛋白。氨基酸比对结果发现，本研究得到的19 株N 蛋白氨基酸序列主要发现以下位点的突变：K123-N123，A142-T142，R241-K241，K252-R252，N255-S255，M394-T394，E400-D400，A408-L408，V402-S402，从而从氨基酸水平证实N 基因缺失很保守。

采用MEGA 5.0 软件构建的基于N 基因的系统进化树发现本研究得到的19 株N 基因序列与CV777、LZC、SM98、CH-S 和DR13 等国内外代表性毒株不在同一个分支上，表明这19 株N 基因序列与传统经典毒株进化关系较远；其中，16 株N 基因序列与MN、USA-Indiana-2013、USA-Iowa107-2013、HRS-1、KGW-1、CH-ZMDZY-11 形成一个分支，为G2a，CH-HENWZ-2015、CH-HENPY-2014、CHHENZ-MDPY-2017 这3 株序列形成另一个分支，为G2b。综上所述，表明我国目前PEDV 的N 基因与以往流行的经典毒株亲缘关系较远，大部分毒株与目前国内外分离的毒株在一个进化分支中，部分毒株独立进化成一个分支。表明PEDV 遗传进化趋势日益复杂，需要长期监控。