天麻素穴位注射对戊四氮致痫模型大鼠脑内海马区凋亡调控因子Bcl-2、Caspase-3表达的影响*

肖 飞，刘 鹏，程光宇，毕海洋，于楠楠

(黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

癫痫(epilepsy)为神经内科疑难病，其患病率仅次于脑卒中疾病，是一种发作突然且短暂，反复发作的中枢神经系统功能失常的脑部疾病[1-2]。迄今为止，随着对癫痫的不断深入研究，普遍认为其发病机制与细胞凋亡及线粒体损伤功能异常等密切相关[3]。Caspase-3即为介导细胞凋亡的核心蛋白酶，活化的Caspase-3更为各种凋亡通路的共同中介，并与线粒体关系密切。癫痫发作可引起线粒体Ca2+超载，使Cyt C由线粒体膜间隙释放入胞浆并与Apal-1结合，Apal-1通过其Caspase结构域激活Caspase-9进而激活其下游的Caspase-3，引起核染色质凝聚，DNA断裂，终使海马神经元凋亡[4-5]。Bcl-2则为抗凋亡的代表，其可调控线粒体通透性而起到抑制细胞凋亡的作用，亦可对Caspase-3的活化起到抑制作用[6]。本研究即通过天麻素穴位注射疗法对戊四氮致痫大鼠行为学及脑内海马区凋亡调控因子Bcl-2、Caspase-3的表达影响进行观察，进一步证实天麻素穴注法干预治疗癫痫模型大鼠疗效肯定，为临床癫痫的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

健康雄性Wistar大鼠120只，SPF级，体质量：250～325 g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。实验大鼠常规适应性喂养1周，在其尾部标记编号，并按随机数字表法分为空白组(N组)、模型组(M组)、穴注组(AI组)及西药组(SV组)，每组各30只。

1.2 实验药物、试剂及配置

天麻素(昆明制药集团股份有限公司，批号：H20013046，0.2 g/支)，充分溶解于150 mL 0.9%氯化钠溶液中(浓度：2 mg/mL)，按人与大鼠等效剂量比例换算，用量为0.37 mL/kg；丙戊酸钠缓释片(山东仁和堂药业有限公司生产，批号：H19983059，0.2 g/片)，加入羧甲基纤维素钠(国药集团化学试剂公司生产)中充分溶解，配成混悬灌胃液(浓度为20 mg/mL)，4℃遮光保存；戊四氮(PTZ,美国Sigma公司,货号：Sigma-P6500)，于每次实验前30 min，取PTZ晶体300 mg，充分溶解于150 mL 0.9%氯化钠溶液配置成PTZ溶液(浓度为2 mg/mL)；10%水合氯醛(购自天津市大茂化学试剂厂)；SABC试剂盒、RT-PCR试剂盒、Western Blot试剂盒、Bcl-2及Caspase-3抗体(上海瑞齐生物科技有限公司)；2 mL无菌注射器(上海米沙瓦医科工业有限公司，国械注准20153152150)。

1.3 模型制备

M、AI、SV组实验大鼠于每日上午8：30—11：30间给予腹腔注射PTZ溶液35 mg/kg，N组每天给予等剂量0.9%氯化钠注射液，连续注射28天以点燃慢性癫痫大鼠动物模型。于每次注射后，观察1 h大鼠的行为变化，而后进行痫性发作评价，根据Racine分级标准[7]对大鼠的痫性发作情况进行评价，并记录每只大鼠的痫性发作等级，对可能发生的意外情况进行干预，如出现3 min及以上的V级发作时，立即以10%水合氯醛腹腔注射以终止其痫性发作，防止死亡。造模周期内，连续5天出现Ⅳ级及以上的痫性发作，视为造模成功，期间对于不符合模型或死亡者应剔除并补充相应数目大鼠保证样本数量恒定。

1.4 干预方法

N组在造模期间给予等时间、等剂量0.9% 氯化钠溶液腹腔注射，连续28天。模型组按上述造模方法给予处置。AI组在造模成功后，参照《实验针灸学》[8]及华兴邦制定的《实验动物图谱》[9]所述方法，选定实验大鼠腧穴百会及大椎，并给予标记,给药时按照0.37 mL/kg的给药剂量将配置好的天麻素溶液均等的注射于上述穴位，注射时百会穴采取平刺0.1 cm进行注射，大椎穴采取直刺0.5 cm进行注射，隔日1次，连续28天。SV组于造模成功后，连续给予配置好的丙戊酸钠溶液(350 mg/kg)灌胃28天，日1次。

1.5 标本取材与检测

用10%水合氯醛(5 mL/kg)麻醉后，常规剪毛、消毒、开胸、灌注、断头，迅速分离海马及脑组织，将1 mm3大小组织块置于2.5%戊二醛固定液中前固定，4℃保存24 h，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，并按试剂盒操作说明书以SABC法检测Bcl-2、Caspase-3阳性细胞数，RT-PCR法检测Bcl-2、Caspase-3 mRNA表达，Western Blot法检测Bcl-2、Caspase-3 蛋白表达。

1.6 统计学处理

以SPSS 20.0软件进行统计学处理，所有数据以均数±标准差表示，进行单因素方差分析及显著性检验。若方差齐时采用LSD法检验，方差不齐时进行转换后再重复以上分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠行为学观察结果

在PTZ造模开始后，模型组大鼠活动较前活跃，进食水明显增多，持续约1 h后趋于平静。模型点燃1周后逐渐出现面部及耳部抽搐、流涎、单侧或双侧前肢抽搐、身体直立甚至互相撕咬，上述症状随点燃次数的增加而逐渐加重，以Ⅰ～Ⅳ级多见；连续注射戊四氮4周后部分癫痫模型大鼠出现Ⅴ级痫性发作。而丙戊酸钠组及穴位注射组模型大鼠在药物干预28天后痫性发作次数明显减少，且发作级别显著下降，以Ⅰ～Ⅱ级为主。

2.2 各组实验大鼠海马区Bcl-2表达

实验结果表明，与N组相比较，M、AI及SV组抗凋亡因子Bcl-2在阳性细胞数、基因及蛋白方面的表达均升高，差异显著(P<0.05)；与M组相比，AI及SV组抗凋亡因子Bcl-2在阳性细胞数、基因及蛋白方面的表达升高更为显著，差异具有统计学意义(P<0.05)；而AI组与SV组相比较，抗凋亡因子Bcl-2在阳性细胞数、基因及蛋白方面的表达未见显著差异(P>0.05)。见表1、图1～2。

表1 各组实验大鼠海马区Bcl-2表达

注：与N组比较，△P<0.05；与M组比较，*P<0.05；与AI组比较，▲P>0.05。

图1 各组Bcl-2阳性细胞数、基因及蛋白的表达

图2 各组Bcl-2蛋白表达

2.3 各组实验大鼠海马区Caspase-3表达

实验结果表明，与N组比较，M、AI及SV组凋亡因子Caspase-3在阳性细胞数、基因及蛋白方面的表达均显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与M组相比，AI 及SV组凋亡因子Caspase-3在阳性细胞数、基因及蛋白方面的表达显著下降，差异具有统计学意义(P<0.05)；而AI组与SV组相比较，凋亡因子Caspase-3在阳性细胞数、基因及蛋白方面的表达未见显著差异(P>0.05)。见表2、图3～4。

3 讨论

调查结果表明，癫痫作为一种发作性疾病，在青少年中活动性癫痫的发作率为8%，而中国西部癫痫持续状态所引发的死亡率为15.9%，严重影响患者的生存质量[10]。因此，对癫痫的治疗已然得到当今社会的强烈关注。在治疗方面，西医多采用口服药物及手术的方式，且以口服药物治疗为主，并取得较好疗效。但在控制癫痫发生的同时，口服药物治疗亦伴有肝肾损伤、认知障碍、内分泌紊乱、电解质紊乱及共济失调等不良反应，且长时间应用口服药物亦伴有依从性差的发生，而手术治疗的成功率较低，故现急迫需要探究一种安全有效、无不良反应的治疗方式。

表2 各组实验大鼠海马区Caspase-3表达

注：与N组比，△P<0.05；与M组比较，*P<0.05；与AI组比较，▲P>0.05。

图3 各组Caspase-3阳性细胞数、基因及蛋白的表达

图4 各组Caspase-3蛋白表达

中医学将癫痫称之为“痫证”“巅疾”。《灵枢》言：“头重痫……四肢之脉皆胀而纵”，首次记载了癫痫发病时肢体痉挛的相关症状，临床多表现为昏不知人、瘛疚抽掣、甚或角弓反张、口吐涎沫等。《丹溪心法》记载：“非无痰涎壅塞，迷闷孔窍”，指出“痰”为痫证发病的根本病因。同时《难经》有言：“重阴者癫，重阳者狂”，且《医述·癫狂痫》亦记载：“天地一阴阳也，阴阳和则天清地凝，一有偏性，遂有非常之变。”指出阴阳和则神清志宁，故在治“痰”的同时，调其阴阳，不使其有所偏胜，则郁逆得消，神气复常。天麻素为中药天麻块茎提取物，据《本草汇言》记载：“天麻...癫痫强痉，四肢挛急”，具有熄风止痉、祛风通络的作用。经现代药理研究表明，天麻具有较好的镇静安眠、镇痛、增加椎基底动脉及小脑下动脉等部位血流量、抗惊厥以及抗癫痫的作用[11]。而天麻素作为天麻的有效成分之一，亦有研究指出其可对抗阵挛性惊厥，具有减轻神经元的损伤并抑制其凋亡的作用，可降低癫痫模型大鼠发作等级[12-13]。

穴位注射又名“水针”，是由传统中医针灸疗法发展而来，将现代提纯药物结合针刺手段输注于相应穴位、经络，进而取得更为显著的疗效。本实验即选用天麻素输注于患者百会穴及大椎穴，以此疗法抑制癫痫模型大鼠痫性发作，效果显著。百会穴首见于《针灸甲乙经》，其位居巅顶之中，为五脏六腑奇经三阳百脉会聚之所。而头为诸阳之会，百脉之宗，故百会穴能通达阴阳脉络，联系周身经络，具有祛痰熄风、醒神开窍，止痉的作用。大椎穴又名百劳穴，首见于《素问·气府》篇，为三阳督脉之会，通诸阳。而督脉入脑络心，故大椎穴能调节阴阳平衡，疏通周身经络，具有醒脑开窍、镇痉熄风的作用。同时百会穴与大椎穴均位于体表，取穴方便，操作简单，故本实验选用天麻素穴注此二穴，以期达到醒脑开窍、祛痰熄风止痉的功效。

而现代医学认为,癫痫的发作与细胞凋亡及线粒体损伤功能异常有关。细胞凋亡又称程序性细胞死亡，癫痫发作尤其在癫痫持续状态时，常有大量海马神经细胞受损进而引起其凋亡，而凋亡的发生又进一步加重了海马神经细胞的损伤，并导致与凋亡相关的因子表达亦发生变化[14-16]，其中Caspase-3作为促凋亡因子以及Bcl-2作为抗凋亡因子，均在癫痫的发作过程中发挥了重要的作用。Caspase家族所产生的级联反应被称为细胞凋亡的中心环节，而Caspase-3为其下游最重要的终末剪切酶，在级联切割途径中处于核心位置[17-18]。研究表明，癫痫所致的海马神经细胞凋亡过程中， 活化的Caspase-3发挥着重要的作用[19-22]。Bcl-2作为Bcl-2蛋白家族中抗凋亡成员，起着维持细胞凋亡-抗凋亡平衡的作用[23]，同时Bcl-2具有抑制线粒体中内源性核酸内切酶及细胞色素C释放的作用，进而可干预Caspase-3活化并发挥抗凋亡的作用，并认为其可能对Caspase-3的合成亦起到一定抑制作用[24-25]。故本实验通过天麻素穴注的方式干预Caspase-3、Bcl-2的表达以明确其调控癫痫发作的作用机制，以期为癫痫的治疗提供新的方向。

实验结果表明，应用天麻素穴注百会及大椎穴干预戊四氮致痫模型大鼠，可有效减少模型大鼠痫性发作的次数，并降低痫性发作的等级。同时天麻素穴注百会及大椎穴亦可有效提高模型大鼠Bcl-2阳性细胞数、基因及蛋白的表达，并降低Caspase-3阳性细胞数、基因及蛋白的表达，与模型组比较差异显著，具有统计学意义(P<0.05)，说明天麻素穴注对癫痫模型大鼠痫性发作具有较好的抑制作用。而天麻素穴注组与丙戊酸钠组模型大鼠海马区Bcl-2、Caspase-3的阳性细胞数、基因及蛋白表达相比较无明显差异(P>0.05)，说明天麻素穴注与丙戊酸钠灌胃治疗对癫痫模型大鼠的治疗效果相当。综上所述，天麻素穴注可有效抑制痫性发作，并调控抗凋亡因子Bcl-2及凋亡因子Caspase-3的表达，进而发挥对海马神经元的保护作用。因此，天麻素穴注治疗癫痫值得临床进一步研究与推广。