烟草黑胫病与青枯病生防芽孢杆菌筛选

张 恒，李金星，陈思颖，丁海霞，余 水， 彭丽娟,4*

(1.黔西南州烟草公司 安龙县分公司，贵州 安龙 552400；2. 贵州大学 农学院，贵州 贵阳 550025；3.贵州大学 烟草学院，贵州 贵阳 550025；4.贵州大学 贵州省烟草品质研究重点实验室，贵州 贵阳 550025)

烟草黑胫病与烟草青枯病是我国烤烟生产中最具破坏性的土传病害，每年造成巨额经济损失，贵州省是我国烤烟生产的主要产区之一，烟草黑胫病与青枯病发生也尤为严重[1-2]，每年由病害造成的经济损失将近亿元[3]，严重影响烟农的经济收入。目前生产上对这2种病害的防治方法主要有：种植抗(耐)病烤烟品种；清洁田园及轮作为主的农业防治措施；化学药剂防治等综合防治措施。但生产实际中尚无合适的抗(耐)优良品种；由于耕地有限，有些烟地不得不连作[4]。因此，生产上大多采用化学药剂防治控制病害。目前药剂防治由于可供选择药剂品种少，主用药剂的使用年限长，病原菌的抗药性逐年增加[5-6]，农药残留及环境污染等负面效应也逐步增加[7]。因此，生物防治近年来已发展成为烟草病害防治研究的热点领域[8-9]。

使用芽孢杆菌进行植物病害的防治是生物防治研究的热点领域之一[10]，芽孢杆菌具备了产业化的前提条件，适应性广；作用机制多样，不易产生抗药性；发酵周期短，生产成本低；能形成芽孢、易储运；环境友好，对人畜安全。芽孢杆菌因其独有的生理特性和理化性质，在工业、农业、医学、环保和军事领域具有重要的应用研究价值。[11]利用芽孢杆菌开发生防制剂成为重要方向[12]。对于烟草土传病害(烟草黑胫病和烟草青枯病)生防芽孢杆菌的筛选国内外也有一些学者进行了尝试[9, 13-17]。据笔者调查，贵州烟草黑胫病与烟草青枯病常常混合发生。筛选同时可防治这2种病害的芽孢杆菌，目前未见报道。本研究从贵州省黔西南州安龙县烤烟种植地块，采集烤烟根际土壤，从中分离、筛选同时拮抗烟草黑胫病菌与青枯病菌的芽孢杆菌菌株，建立芽孢杆菌资源库，为之后贵州烟草病害生防制剂的研发打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1土样采集

于2017～2018年从贵州省黔西南州安龙县烟草黑胫病和青枯病发病地块采集健康烟株根际土样，采用5点取样法，将同一地块土样混合算1份土样。具体采集时间、地点见表1。使用纸袋收集土样，土壤采集工具提前消毒，避免土壤微生物混杂。

1.1.2培养基

LB培养基用于芽孢杆菌分离保存，筛选拮抗烟草青枯病菌的芽孢杆菌平板对峙实验[17-18]；PDA培养基用于筛选拮抗烟草黑胫病菌的芽孢杆菌平板对峙实验[17-18]。

1.1.3供试菌株

烟草黑胫病菌(Phytophthoranicotianae)和烟草青枯病菌(Ralatoniasolanacearum)由贵州大学农学院植物病理学教研室提供。

1.2 根际芽孢杆菌分离与保存

采用稀释平板法，将土壤稀释悬浮液于85 ℃水浴30 min以杀死绝大部分非芽孢细菌。取100 μL稀释液涂LB平板，每浓度涂平板3个，37 ℃培养1 d后，挑取不同单菌落，纯培养并保存于-80 ℃冰箱[18]。

1.3 烟草黑胫病菌与青枯病菌拮抗芽孢杆菌筛选

通过平板对峙法筛选拮抗烟草黑胫病菌与青枯病菌效果明显的芽孢杆菌，通过初筛与复筛观察是否产生抑菌圈，十字交叉法测量其抑菌直径[19-20]。

抑菌率(%)=[(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/处理组菌落直径]×100

1.4 生防菌株鉴定

通过形态学、生理生化特征及16S rDNA基因对筛选的菌株进行鉴定[21]。

1.4.1菌落形态观察

接种菌株至含有5 mL LB培养液的试管中，37 ℃过夜摇培，离心收集菌体，无菌水清洗3次菌体，用无菌水重悬并稀释至浓度1×108CFU/mL，在LB液体和固体培养基上滴加10 μL菌液，37℃培养3 d后观察菌落形态[21]。

1.4.2生理生化特征

根据《伯杰氏系统细菌学手册》[22]，对菌株生理生化特性进行测定。

1.4.3分子生物学鉴定

50 mg/mL溶菌酶37 ℃水浴1 h处理菌体，采用Biomiga细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。以基因组DNA为模板，16S rDNA 通用引物27F/1492R[23]进行PCR扩增，PCR产物验证正确后送上海生工进行测序。测序结果于NCBI数据库进行BLAST比对分析，并利用CLUSTAL X软件进行多序列比对和系统进化分析软件MEGA6.0中的Neighbor-Joining算法构建系统发育树[24]。

2 结果与分析

2.1 烤烟根际芽孢杆菌资源库的建立

在安龙县主要烤烟种植生态区的主栽品种上采集健康烟株根际土壤共15份，分离根际芽孢杆菌(见图1)，建立烤烟根际芽孢杆菌资源库(见表1)，共保存芽孢杆菌662株。

(a)稀释涂板得到芽孢杆菌单菌落；(b)纯化菌株；(c)保存菌株图1 烤烟根际土壤中分离芽孢杆菌并保存Fig.1 Isolation and preservation of Bacillus strains from tobacco rhizosphere soil

表1 土壤样品采集Tab.1 Information of soil samples

2.2 烟草黑胫病菌与青枯病菌拮抗芽孢杆菌筛选

以烟草黑胫病菌(P.nicotianae)和青枯病菌(R.solanacearum)为供试植物病原菌，采用平板对峙法筛选同时可拮抗2种病原菌的芽孢杆菌，经初筛与复筛，得到拮抗效果较好的芽孢杆菌2株，分别编号为AL203和AL210(图2～图5)。

CK：烟草青枯病菌(R. solanacearum)；AL203、AL210表示筛选到的具有拮抗效果的芽孢杆菌菌株图3 芽孢杆菌对烟草青枯病菌拮抗效果初筛Fig.3 Biocontrol efficacy of bacterial isolates toward R. solanacearum in the first screening

(a)烟草黑胫病菌(P. nicotianae)；(b)(c)表示筛选到的具有拮抗效果的芽孢杆菌菌株图4 芽孢杆菌对烟草黑胫病菌拮抗效果复筛Fig.4 Biocontrol efficacy of bacterial isolates toward P. nicotianae in the second screening

(a)烟草青枯病菌(R. solanacearum)；(b)(c)为筛选的具拮抗作用的芽孢杆菌菌株图5 芽孢杆菌对烟草青枯病菌拮抗效果复筛Fig.5 Biocontrol efficacy of bacterial isolates toward R. solanacearum in the second screening

2.3 生防菌株鉴定

AL203、AL210均可在LB固体与液体培养基上形成比较复杂的菌落结构(图6)。菌株的生理生化特性见表2，2菌株均为G+，均可分解葡萄糖、鼠李糖和甘露醇，均产生过氧化氢酶和硝酸还原酶，甲基红染色阳性，可液化明胶等特征。通过16S rDNA基因序列分析，构建菌株AL203、AL210的16S rDNA系统发育树，结果显示，菌株AL203、AL210与解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)聚到一个分支(图7)。AL203、AL210的16S rDNA基因序列已提交GenBank数据库，序列号分别为MK103124和MK103125。通过形态学、生理生化特性及16S rDNA基因鉴定AL203、AL210为解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)。

图6 菌株AL203、AL210在LB液体、固体培养基上菌落形态Fig.6 Colony morphology on liquid and solid LB media

生理生化特征AL203AL210革兰氏染色Gram stain++VP试验Voges Proskauer tests++甲基红Methyl red tests++柠檬酸盐Citrate++过氧化氢Catalase++淀粉水解Starch hydrolysis++明胶液化Gelatin liquefactiong++硝酸还原酶Nitrate reductase++亚硝酸还原酶Nitrite reductase--葡萄糖Glucose++α-L-鼠李糖alpha-L-Rhamnose ++甘露醇mannitol ++

+：阳性反应；-：阴性反应

图7 菌株AL203和AL210 16S rDNA系统发育树Fig. 7 Phylogenetic analysis of Bacillus strains based on 16S rDNA gene sequences

3 结论与讨论

本研究从贵州省黔西南州安龙县烟草黑胫病和青枯病发病严重地块采集健康烟株根际土壤15份，从中分离得到芽孢杆菌662株，建立烤烟根际芽孢杆菌资源库。从中筛选分离到2株芽孢杆菌AL203、AL210，具同时拮抗烟草黑胫病菌(P.nicotianae)与青枯病菌(R.solanacearum)的能力。通过形态学、生理生化特性及16S rDNA基因鉴定，AL203、AL210为解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)。

解淀粉芽孢杆菌作为一种安全、高效、多功能和极具开发潜力的芽孢杆菌已经成功商品化应用投放市场，如由解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens) FZB42作为主要成分的杀菌剂BioYield，可防治多种植物真菌和细菌病害[21]，因此AL203、AL210也具备开发成商品化制剂的潜力。解淀粉芽孢杆菌可产生多种抗菌物质抑制植物病原菌，研究发现，芽孢杆菌抗真菌活性来源于环脂肽类抗生素，而抗细菌活性则可能由于聚酮类物质和核糖体合成途径产生的细菌素[21]。这些物质可抑制细菌生长和真菌菌丝生长及孢子的萌发[22]。但不同芽孢杆菌基因组差异较大，因此，AL203、AL210产生的抑菌物质还需进一步研究。AL203、AL210均能够在液体和固体培养基表面形成较为复杂的菌落形态，前人研究表明生防芽孢杆菌形成的复杂的菌落结构是其发挥定殖能力的先决条件，而定殖也是生防菌发挥生防功能的前提的条件[21]，因此AL203、AL210具备潜在的优秀的定殖能力和生防潜力。下一步将通过研究AL203、AL210对烟草黑胫病与青枯病的田间防治效果来进一步验证。

本研究是贵州生态区域和种植模式下收集合适的防治烟草土传病害效果良好的生防芽孢杆菌进行初步研究，为以后相关生防制剂的开发提供了理论依据。