梵净山丛枝菌根真菌三个中国新记录种

姚莉梅，石 磊， 李海波，尚 昆，朱青青，周光荣，江 龙*

( 1.贵州大学 生命科学学院/山地植物资源保护与种质创新教育部重点实验室，贵州 贵阳 550025；2. 贵州梵净山国家级自然保护区管理局，贵州 江口 554400)

丛枝菌根(Arbuscular mycorrhizal， AM)真菌是属于球囊菌门(Glomeromycota)中的一类营养共生真菌，可与大多数植物形成共生体[1]。按照http:// www.amf-phylogeny.com网站上整理公布的数据，目前在世界范围内发表的AM真菌共有4目11科36属334种，中国记录近两百种[2]。梵净山国家自然保护区位于贵州省铜仁市，是武陵山脉主峰，1992年被世界自然保护联盟(IUCN)列为具有全球意义的A级保护区，2018年被列入“世界自然遗产名录”。全区生态系统保存完好，基本没有人为扰动，是当今地球同纬度生物多样性保存最为完好的地区，拥有高等植物303科1266属3728种，是研究AM真菌物种多样性的极佳样地[3]。目前仅陶光耀[4]与袁腾[5]进行了初步调查，鉴定报道的AM真菌种类12属42种，接近国内AM真菌物种数量的1/4，说明该保护区AM真菌种类十分丰富。因此开展梵净山自然保护区土壤中AM真菌的调查与研究，在丰富我国丛枝菌根真菌资源和开发应用方面有重要意义。通过对梵净山植物根际土壤AM真菌的物种鉴定，我们发现了三个国内新记录种，现予报道。

1 材料与方法

1.1 采集土样

采样地位于贵州省铜仁市梵净山自然保护区，采集土样时，除去土壤表面约2 cm的腐殖土与杂质，采集距离地表约5～30 cm土层土壤，约1 kg装入采样袋中，自然风干后放4℃冰箱中进行保存以备用[6]。

1.2 分离鉴定

土壤AM真菌孢子采用湿筛倾注-蔗糖离心法[7]进行分离。在体视显微镜下对分离到的孢子进行其大小、形状、颜色及连孢菌丝进行初步观察及分类，再将孢子洗净后吸取到载玻片上，置于生物显微镜(Olympus BX53)和摄影系统(Olympus DP70)下，对孢子大小、形状、颜色、连孢菌丝、孢子壁及发芽壁的层数和厚度、孢子压破后的内含物及在Melzer’s试剂中的染色情况、孢子表面有无纹饰或附着物等特征进行详细观察、记录，并照相[8]。再依据http:// www.amf-phylogeny.com网站、国际丛枝菌根真菌保藏中心(INVAM)(http://invam.caf.wvu.edu)、和http://www.zor.zut.edu.pl/Glomeromycota等网站提供的种属描述及其相应的图片，结合贵州大学AM真菌保藏资源，进行属种鉴定，中文学名参见王幼珊等(2017)[9]球囊菌门丛枝菌根真菌最新分类系统菌种名录。

2 结果与讨论

经孢子形态学鉴定，从贵州省铜仁市梵净山自然保护区植物根际土壤中共分离、鉴定出AM真菌中国新记录种3种，双型囊霉属(Ambispora)、多样孢囊霉属(Diversispora)、隔球囊霉属(Septoglomus)各1种。下面是详细描述和图示。

2.1 网纹双型囊霉Ambispora reticulata Oehl & Sieverd(2012).(图1)

孢子果未见。孢子在土壤中单生，幼嫩孢子白色，成熟孢子黄棕色，球形至近球形，大小89～140 μm。孢子壁有2层，L1为透明至淡黄色，厚1 μm左右，随着孢子成熟逐渐消失，成熟孢子几乎不可见；L2为无色透明至浅黄色，厚2～5 μm，在Melzer’s试剂中发生反应，呈现紫红色。孢子壁两层：GW1两层紧贴，均为无色透明膜状壁，GW1-L1半柔性，厚1.1～3.0 μm，表面具有特殊的网状纹饰，有由脊包围的不规则形状的凹坑，形状为三边形到八边形，宽3.2～9.6 μm，深0.5～2.1 μm；GW1-L2光滑，厚1 μm左右，在Melzer’s试剂中不发生反应；GW2双层：GW2-L1为透明刚性壁，厚1.3～3.5 μm，GW2-L2透明，厚度很薄，很难观察到，发芽壁在Melzer’s试剂中无反应。孢子梗：由孢子壁和发芽壁的外层延伸形成，在孢子基部宽6～16 μm×4～17 μm，GW1-L1的网状纹饰延伸到孢子梗呈波浪状纹饰。在Melzer’s试剂中不反应[10]。

Fritz Oehl(2010)[10]在瑞士阿尔卑斯山和亚高山草原上首次发现网纹双型囊霉Ambisporareticulata，观察到第一层发芽壁上有特殊的网状纹饰结构，是区分双型囊霉属其它物种的识别特征。我们从梵净山植物根际土壤中分离得到的孢子经过观察，在第一层发芽壁上可明显观察到该种的识别特征-网纹纹饰结构(图1-1,4,7～12)，且纹饰的形状(图1-4)、宽度与深度(图1-9,11～12)也与该种识别特征一致，此外孢子颜色、大小及其与Melzer’s试剂的反应结果(图1)与Fritz Oehl的描述一致，因此确定为网纹双型囊霉Ambisporareticulata。

1.反射光 2.透射光 3.水相中完整孢子，可见孢子梗 4.特殊网纹纹饰 5. Melzer’s试剂中的完整孢子，孢子壁L2层有紫红色反应 6-7.破裂孢子在水中的孢子壁及发芽壁结构 8-12. Melzer’s试剂中的破裂孢子，L2层有紫红色反应，GW1、GW2和孢子梗均没有反应，呈现微黄色

1.reflected light 2.transmitted light 3.complete spore in water phase, spore stalk can be seen 4.special reticulatad pattern 5.complete spore in Melzer's reagent, and purple red reaction in L2 layer of spore wall 6-7.spore wall and sprouting wall structure of broken spores in water 8-12.broken spores in Melzer's reagent showed purple red reaction in L2 layer, while GW1, GW2 and spore stalk showed slight yellow reaction

图1 网纹双型囊霉
Fig.1 Morphological characters ofAmbisporareticulata

标本号：Inl20181025FJ-5、Fas20181025FJ-41、Fas20181025FJ-48、Rhs20181025FJ-108、Rhg2018 1025FJ-112、Rhs20181025FJ-113、Rhr20181025FJ-118、Inb20181025FJ-128、Int20190725FJ-8、Imst-20190725FJ-13、Cajt20190725FJ-25、Fas20190725FJ-31、Inl20190725FJ-41、Que20190725FJ-53、Phy-20190725FJ-81，孢子于2018年10月从贵州省梵净山自然保护区阔叶箬竹Indocalamuslatifolius、箭竹Fargesiaspathacea、贵州杜鹃Rhododendronguizhouense、大钟杜鹃Rhododendronririei、巴山箬竹Indocalamusbashanensis，以及2019年7月从黄金凤Impatienssiculifer、巴东栎Quercusengleriana、山茶Camelliajaponica、箭竹Fargesiaspathacea、毛竹Phyllostachysedulis、箬竹Indocalamustessellatus、阔叶箬竹Indocalamuslatifolius根际土壤中分离得到。

2.2 光亮多样孢囊霉Diversispora clara Oehl, B. Estrada, G.A. Silva & Palenz. (2012).(图2)

孢子果未见。孢子在土壤中单生，透明至奶白色，球形(63～112 μm)或近球形(67～127×63～122 μm)。孢子壁三层：L1透明，厚度<1 μm，在成熟过程中逐渐消逝，因此在成熟孢子中经常不存在；L2层状壁，明亮至较少的乳白色，厚度3～5.3 μm；L3透明，厚1 μm左右，通常与L2紧密粘附，不易观察。L1和L2在Melzer’s试剂中被染色为黄色，孢子细胞的内容物为油状液滴，在Melzer’s试剂中被染成比细胞壁更深的黄色。孢子具有亮白色连孢菌丝，常单生，形状为圆柱形，空隙少见打开，常在基部或离基部较近处由L2和L3的隔膜封闭[11]。

Beatriz Estrada(2011)[11]等人从西班牙10种金盏花植物根际土壤中首次发现光亮多样孢囊霉Diversisporaclara，该种孢子颜色较该属其他孢子透明，孢子壁较薄，连孢菌丝圆柱形，且在孢子基部或离孢子基部较近的地方有隔膜封闭。我们分离到的孢子颜色透明(图2-2～4)、孢子壁较薄(图2-4～8)，连孢菌丝圆柱形且在离孢子基部较近处有隔(图2-3)，孢子形态特征与Beatriz Estrada等人描述一致，由此确定为光亮多样孢囊霉Diversisporaclara。

1.反射光 2.透射光 3.水相中完整孢子，可见连孢菌丝 4.破裂孢子，可见孢子壁结构 5-8. Melzer’s试剂中的孢子壁结构，孢子壁L2被染成暗黄色结构，L3不反应

1.reflected light 2.transmitted light 3.complete spores and hyphae can be seen in the water phase 4.broken spore, spore wall structure can be seen 5-8.spore wall structure in Melzer's reagent, spore wall L2 was stained dark yellow structure, and L3 did not react

图2 光亮多样孢囊霉
Fig.2 Morphological characters ofDiversisporaclara

标本号：Inl20181025FJ-5、Fas20190725FJ-38、Int20190725FJ-45，孢子于2018年10月从阔叶箬竹Indocalamuslatifolius以及2019年7月从贵州省梵净山自然保护区箬竹Indocalamustessellatus和箭竹Fargesiaspathacea根际土壤中分离得到。

2.3 高山隔球囊霉Septoglomus altmontanum Palenz., Oehl, Azcón-Aguilar & G.A. Silva (2013).(图3)

孢子果未见。土壤中单生，深红棕色至红黑色，形状椭圆形至近球形，大小130～190×121～167 μm。孢子壁两层：L1为半透明至暗黄色壁，光滑，厚2.2～3.7 μm；L2为深红棕色至红黑色的层状壁，厚4.0～7.6 μm，两层孢子壁在Melzer’s试剂中不发生反应。连孢菌丝颜色稍浅于孢子颜色，为暗黄色至红色，形状为圆柱形，偶尔为漏斗形，常发生弯曲；常在孢子基座处达到最宽19～31 μm，连孔常被L2延伸形成隔。连孢菌丝与Melzer’s试剂中也不发生反应[12 ]。

Javier Palenzuela(2013)[12]等人在对麦冬根际土壤丛枝菌根真菌进行调查时，首次报道了高山隔球囊霉Septoglomusaltomontanum。该种孢子较大，颜色较深，尤其是连孢菌丝较宽，最宽处可达35 μm，是高山隔球囊霉Septoglomusaltomontanum与该属其他种区分的主要识别特征[11]。我们分离的孢子连孢菌丝结构最宽处可达31 μm(图3-7～8)，在孢子颜色、形状上都与Javier Palenzuela等人的描述一致(图3)，因此确定为高山隔球囊霉Septoglomusaltomontanum。

标本号：Irt20181025FJ-38、Fas20181025FJ-60、Woj20190725FJ-72、Phh20190725FJ-28、Hys-20190725FJ-30、孢子于2018年10月从贵州省梵净山自然保护区鸢尾Iristectorum、箭竹Fargesiaspathacea，以及2019年7月从狗脊蕨Woodwardiajaponica、腊莲绣球Hydrangeastrigosa、毛竹Phyllostachysedulis根际土壤中分离获得。

梵净山国家级自然保护区原生生态系统保存完好，因其独特的气候及地理位置，具有梵净火绒草、梵净山冠唇花、梵净山铠兰等许多特有的生物物种[13]，梵净山AM真菌资源也十分丰富，目前我们已经在该保护区共分离鉴定出13属58种AM真菌，占全球AM真菌种质资源17%，占国内29%。此次三个新记录种的发现，进一步说明梵净山自然保护区AM真菌的物种多样性丰富。

1.反射光 2.透射光 3.水相中完整孢子，可见孢子壁L1和连孢菌丝 4.破裂孢子，可见孢子壁L2和连孢菌丝隔膜 5-8.Melzer’s试剂中的孢子壁结构和连孢菌丝隔膜结构，孢子壁L2和连孢菌丝均不反应

1.reflected light 2.transmitted light 3.complete spores in the aqueous phase, with spore wall L1 and hyphae hyphae visible 4.broken spores, spore wall L2 and hyphae septum can be seen 5-8.spore wall structure and hyphae membrane structure, spore wall L2 and hyphae did not respond in Melzer's reagent

图3 高山隔球囊霉
Fig.3 Morphological characters ofSeptoglomusaltomontanum