麝香酮处理后CIRI模型大鼠海马组织中S100β、NF-κB表达变化研究*

肖珍科，黎贤泰，王 保，尧新华，张立贤

1.广州市中医医院麻醉科(广州 510130)；2.广州市红十字会医院麻醉科(广州 510220)

麝香是许多名贵特效急救中成药如安宫牛黄丸、局方至宝丹等发挥药效所不可或缺的主要药味，它具有开窍、醒神、活血通络、消肿止痛的功效，主治热病神昏、中风痰厥等证，麝香酮是天然麝香的主要有效成分。目前的研究表明，麝香酮对脑损伤有明确疗效，本研究设计对大鼠CIRI模型腹腔灌注麝香酮，检测灌注前后大鼠测定海马组织中S100β、NF-κB p65 活性值的变化，观察麝香酮对CIRI的干预效果。

资料和方法

1 一般资料

1.1 实验动物及分组：采用健康SD老年大鼠60只(广州中医药大学实验动物中心提供，许可证号SCXK(粤)20130034)。随机分为缺血再灌注组(CIRI)，麝香酮组(SXT)和生理盐水对照组(CON)。CIRI即脑缺血再灌注损伤模型组，大鼠腹腔内注射2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉，麻醉后于大鼠颈部正中切口，分离双侧颈总动脉和迷走神经，用小动脉夹夹闭双侧颈总动脉20 min后打开动脉夹，再灌注2 h，断头处死大鼠。SXT即麝香酮组，提前2 h对SD老年大鼠腹腔注射麝香酮溶液(3.6 mg/kg)，每小时注射一次，后造CIRI大鼠模型。CON表示SD老年大鼠灌胃给予生理盐水，其余操作同SXT。处死大鼠后取海马区脑组织，采用凝胶电泳迁移分析法测定海马组织中S100β、NF-κB p65活性值。实验分两次完成，每次完成30只大鼠实验。

1.2 实验仪器：垂直电泳仪及转移系统(BIO RAD)、射线摄影暗匣(5X7英寸富士X光片发光暗盒，广州艺佳生物)、脱色摇床(Rotomix公司)等。

1.3 实验试剂：蛋白提取液(碧云天生物)、十二羟硫酸钠(SDS)(广州威佳)、二硫苏糖醇(DTT)(Sigma)、甘油(国产)、丙烯酰胺(Sigma)、N，N-亚甲基丙烯酰胺(Bis-Acrylamide)(Sigma)、四甲基乙二胺(TEMED)(上海生工)、过硫酸铵(AP)(广州化学试剂厂)、甘氨酸(鼎国)、Tris碱(Sigma)、甲醇(广州化学试剂厂)、Tween-20(Sigma)、脱脂奶粉(伊利)、PVDF膜(BIO RAD)、一抗S100β(ABCAM，AB52642，1：4000)、一抗NF-κB(ABCAM，AB16502，1：2000)、羊抗兔IgG/HRP(BA1055博士德)、羊抗小鼠IgG/HRP(BA1051博士德)、β-actin(3700 CST)。

2 实验方法与步骤

2.1 溶液的配制：①30%丙烯酰胺 100 ml。②1.5 mol/L pH8.8Tris-HCL 100 ml。③1.0 mol/L pH6.8Tris-HCL 100 ml。④10%SDS 100 ml。⑤10%过硫酸铵100 ml。⑥TEMED购自成品。⑦2 X SDS凝胶加样缓冲液。⑧1 mol/L DTTl。⑨脱色液 100 ml。⑩Tris-甘氨酸电泳缓冲液 1000 ml；染色液180ml。

2.2 凝胶的配制 一般配制凝胶浓度为12%。先配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶，加入TEMED后，再配制成浓缩胶。

2.3 样品的前处理：裂解后的样品离心后进行BCA蛋白定量测定。

2.4 免疫印迹：上样与电泳，转膜，封闭，一抗孵育，二抗孵育，发光显影，得到显影条带。

3 观察项目 记录每组所显影的条带，应用Image J软件分析各条带灰度值。

结 果

麝香酮能降低CIRI大鼠海马区脑组织的S100β、NF-κB p65活性值，与空白组比较差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。

表1 各组大鼠海马区脑组织的S100β、NF-κB p65含量比较

注：与空白组比较，◇P<0.01；与对照组比较，◆P<0. 05

讨 论

S100β蛋白是构成神经胶质细胞胞液的主要成份，当脑损伤尚处于无症状的亚临床状态时，结构上受损的神经胶质细胞会释出S100β进入脑脊液。这说明在对脑损伤的检测中，S100β有较高的特异性[1-3]。核转录因子NF-κB (NF-κB) 是普遍存在于真核细胞中的一种转录因子，具有多向转录调节作用，1986 年首先发现它是 B 淋巴细胞中免疫球蛋白 κ轻链转录所需的核转录因子，故命名 NF-κB[4]。NF-κB参与多种细胞因子和炎症介质的转录调节。脑缺血再灌注可导致NF-κB的激活在许多研究中都已得到证实。NF-κB 表达部位与缺血时间有关[5-6]。而敲除P65基因的小鼠在同样条件下的缺血性脑损伤明显减轻，说明NF-κB 在脑缺血中具有促进细胞损伤的作用[7]。近年来，NF-κB 的活化被认为是介导和加剧 CIRI的重要环节，并开始初步探讨阻断NF-κB 激活过程保护脑组织[8]。正常情况下，在大脑皮层和海马区域，NF-κB与其抑制蛋白 IκB 结合，处于低水平状态。脑缺血再灌注后，氧化应激的产生导致白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α 等细胞因子增多，通过与靶细胞表面的特异性受体结合，引起信号在胞质内的释放和传导[9]，最终导致 IκB 在 IκB 激酶( IκB ki-nase，IKK) 的作用下发生磷酸化而降解，与 NF-κB解离，游离NF-κB p65 迅速由细胞质移位到细胞核，与多种基因的启动子部位 κB 位点结合，转录调节多种细胞因子和炎症介质、黏附分子、生长因子等[10]。通过抑制 CIRI 大鼠NF-κB 的表达，或者降低局灶性 CIRI 大鼠NF-κB p65的活化，调控NF-κB p65 信号通路上的关键信号分子，从而改善大脑缺血所致的神经元凋亡，减轻脑缺血再灌注损伤[11-13]。

麝香酮(3-甲基环十五烷酮)是人工麝香中的主要活性成份，具有抗痴呆、抗脑缺血、抗炎等多方面药理作用。研究证明麝香酮对神经母细胞瘤细胞缺氧缺糖和再给氧损伤具有显著的保护作用，提示麝香酮有可能用于中风病急性期的治疗[14]；它能明显缩小脑缺血再灌注损伤模型大鼠的脑梗塞体积，减轻脑缺血再灌注所引起的神经细胞损伤，其作用机制主要为[15-19]：增加大脑组织SOD含量，降低MDA含量，减轻缺血、缺氧造成的兴奋性氨基酸含量，抑制兴奋性氨基酸导致的兴奋性神经毒性；抑制谷氨酸通过N-甲基-D-门冬氨酸(NMDA)受体介导的神经元内 Ca2+超载，降低乳酸脱氢酶(LDH)释放，稳定细胞线粒体膜电位；减少谷氨酸转运体EAAC1 逆向转运，减轻兴奋毒性，抑制氧化损伤，减少EEACl mRNA 表达，抑制NMDA受体的激活，抑制 Ca2+-Ca MKII和ASK-1/JNK/p38 信号通路，调节B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)家族的表达等；还可以通过刺激交感神经兴奋，使脑动脉中的β受体兴奋，脑血管紧张度降低，弹性改善，血管扩张，促使脑血流量增加，使脑组织氧含量和能量代谢等得到充分改善，从而保护脑缺血后神经元的损伤。另外，大鼠局灶性脑缺血损伤模型大鼠给予麝香酮后，能减轻缺血、缺氧造成的血脑屏障通透性改变，减少蛋白质漏出，从根本上降低脑细胞的水肿程度，并对海马CA3区神经元凋亡发生影响，防止脑缺血病程发展，从而发挥对脑缺血保护作用[20-21]。

本次实验结果SXT与CIRI比较，S100β及NF-κB p65蛋白相对灰度明显下降，表明麝香酮能明显降低CIRI模型大鼠的S100β和NF-κB p65值，提示麝香酮抗CIRI的作用与减少S100β蛋白释放，减少NF-κB蛋白表达，减轻兴奋性氨基酸毒性有关，说明麝香酮腹腔内灌注对POCD可能有一定的预防效果。

SXT与CON比较，S100β的变化有明显差别，而NF-κB p65的变化无明显差别，提示中药方剂的起效方式较复杂，其中单味药材有效成分所起的作用有限，还需要做进一步研究。