橡胶树多主棒孢病菌Cassiicolin基因条形码数据库构建及分子检测技术

李博勋 刘先宝 冯艳丽 解惠婷 黄贵修

摘  要  多主棒孢（Corynespora cassiicola）是為害我国主要热带作物的植物病原真菌，其寄主范围广、形态差异显著、症状类型多样，且含有一种寄主专化性毒素Cassiicolin，存在6种毒素类型。本研究利用已公布的Cassiicolin毒素基因（Cas1～Cas6型），构建了含287个菌株的国内橡胶树和部分热带作物多主棒孢Cassiicolin基因条形码数据库，建立了一套特异性强、灵敏度高的分子检测技术，可检测100 pg/μL的目标基因组DNA，系统分析了我国橡胶树、木薯、番木瓜、瓜菜等主要热带作物的919株多主棒孢的毒素类型，发现国内仅存在Cas2和Cas5这2种毒素类型，其中Cas5型的菌株占94.8%，为橡胶树多主棒孢的优势种群和特有毒素类型。而Cas2型是橡胶树和其他作物多主棒孢共有的毒素型。系统发育分析发现，不同毒素类型的多主棒孢菌株与寄主来源密切相关，但与地理来源没有明显的相关性，且Cas5型多主棒孢具有明显的寄主专化性。通过构建多主棒孢Cassiicolin基因条形码数据库，为明确我国主要热带作物多主棒孢病菌的种群结构和优势种群情况，发掘、保存多主棒孢菌种资源以及制定病害的防治策略上具有重要的指导意义。

关键词  多主棒孢;Cassiicolin毒素基因;DNA条形码;分子检测中图分类号  S763.7      文献标识码  A

Construction of Cassiicolin Genes Barcode Database and Molecular Detection Technology of Corynespora cassiicola from Hevea brasiliensis in China

LI Boxun， LIU Xianbao， FENG Yanli， XIE Huiting， HUANG Guixiu^*

Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Integrated Pest Management on Tropical Crops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Hainan Key Laboratory for Monitoring and Control of Tropical Agricultural Pests， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract  Corynespora cassiicolais a plant pathogenic fungus， which is harmful to major tropical crops in China. It has a wide range of hosts， significant morphological differences， diverse symptoms and contains a host-specific toxin， which encoding up to six distinct protein isoforms. In the study， we used public database to construct Cassiicolin genes barcode database ofC. cassiicolaform major tropical crops in China. At the same time， we established a set of molecular detection techniques with high specificity and sensitivity， which could detect 100 pg/μL target genomic DNA. Then， we systematically detected the isoforms cassiicolin ofC. cassiicola， which were isolated from rubber tree， cassava， papaya， melon and vegetable in China. There were only two isoforms Cassiicolin in China， among which the Cas5 isoform Cassiicolin accounted for 94.8%， and had obvious host specificity and was specific and advantage population on rubber tree in China. Phylogenetic tree analysis showed that distinct isoforms Cassiicolin ofC. cassiicolawas closely related to host origin， but not to geographical origin. The results of the research would significantly contribute to the population genetic structure， dominant population， preservation ofC. cassiicolaand control strategies.

Keywords  Corynespora cassiicola; Cassiicolin genes; DNA barcoding; molecular detection

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.09.015

多主棒孢（Corynespora cassiicola）是一种重要的植物病原真菌，其寄主范围十分广泛，可侵染为害热带地区主要经济作物（橡胶树、木薯）、瓜菜、果树和花卉等，生理小种复杂，侵染破坏力极强，病斑类型多样，具有丰富的遗传多种样性^[1-4]。該菌含有特别的寄主专化性毒素Cassiicolin，是一种新型结构的毒素蛋白，这也是该菌最主要的致病因子，存在6种毒素类型^[5]。Atan等^[6]通过致病谱差异确定了橡胶树多主棒孢可能存在2个生理小种，结合RAPD、rDNA-RFLP和ISSR标记可将2个生理小种在遗传学方面进行有效区分，Shukor等^[7]推测，在橡胶树上可能存在第3个生理小种，但至今仍未明确多主棒孢的生理小种。现有研究表明，多主棒孢的遗传进化支与寄主来源密切相关，但与其形态特征、致病性、地理来源以及品种（系）之间没有明显的相关性。Déon等^[8]通过Cassiicolin毒素基因、ITS、ga4、caa5，以及act1基因序列对不同寄主植物和地理来源多主棒孢分离物的多样性进行了分析，其中47%供试分离物中检测到Cassiicolin编码基因，可编码6种不同类型的蛋白质，通过定义的Cassiicolin毒素类型使聚类分析结果更加清晰明了。刘先宝等^[9]分析了国内橡胶树多主棒孢Cassiicolin毒素的多样性与致病力分化之间的关系，初步获得了橡胶树上多主棒孢的主要毒素类型。因此，在多主棒孢的生理小种尚未确定的情况下，国际上常利用Cassiicolin基因编码的6个毒素类型，来进一步划分多主棒孢病菌的致病型，这也是现阶段研究多主棒孢分类的主要依据。

多主棒孢在我国分布较广，为害的作物种类多，研究价值大。而传统的鉴定方法常根据寄主、病斑类型、病原菌的形态特征、培养性状等进行区分，而多主棒孢病菌造成的病斑类型多样，病原菌极容易变异，而且不同类型的多主棒孢菌株的形态特征和培养性状上存在一定的差异。而Cassiicolin毒素基因是多主棒孢基因组中一段公认的、特有的、相对较短的DNA序列，能将多主棒孢与其他真菌进行有效区分、精准鉴定。为此，本研究拟构建多主棒孢Cassiicolin基因条形码数据库，利用该数据库对国内主要热带作物多主棒孢菌株进行鉴定，明确病原菌的遗传结构和优势种群，建立多主棒孢病菌的早期分子检测技术。这对明确我国主要热带作物多主棒孢的种类组成，系统发育与寄主的多样性关系，发掘、保存多主棒孢菌种资源以及制定病害的防治策略上具有重要意义。

1  材料与方法

1.1材料

1.1.1  供试菌株  287株多主棒孢菌株（表1）以及用于分子检测的其他病原菌菌株均由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所热带工业原料作物病害研究组分离和保存，其中橡胶多主棒孢275株，其他寄主多主棒孢12株。NCBI数据库下载的多主棒孢Cassiicolin基因信息（表2）。

1.1.2  培养基与试剂  PDA培养基参照《植病研究方法》配制^[10]，用于多主棒孢菌株的培养。引物（表3）均由华大基因股份有限公司合成;克隆载体pMD18-T、PCR扩增反应试剂购于TAKARA公司;pMD18-T载体、TaqDNA聚合酶、dNTP等购自宝生物工程（大连）有限公司。DNA Maker、Trans5α大肠杆菌感受态购自北京全式金生物技术有限公司。其他化学试剂均为国产分析纯。

1.1.3  仪器与设备  Bio-Rad T100型梯度PCR仪，美国伯乐公司; UVI FireReader凝胶成像系统，英国UVItec公司。

1.2方法

1.2.1  DNA提取、PCR扩增和测序  采用CTAB方法^[11]提取病原菌DNA，用超微量分光光度计进行DNA质量测定，用Cassiicolin引物序列（表3）对病原菌目的基因进行PCR扩增，反应条件参照Déon等^[5]的方法，扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，经Omega Bio-Tek试剂盒进行目的条带回收之后克隆到pMD18-T载体，转化Trans5a大肠杆菌感受态细胞。筛选阳性克隆转化子，送华大基因技术有限公司进行序列测定。

1.2.2  序列分析、遗传距离计算和系统发育树构建  将序列在NCBI中进行BLAST分析，利用CodonCode Aligner V7.0.1去除测序峰图的低质量区域、完成峰图校对拼接和引物序列切除，应用PUAP 4.0软件计算种内、种间遗传距离;利用MEGA7.0软件最大似然法中的Tamura-Nei model构建系统发育树。

1.2.3  分子检测技术  用Cassiicolin引物对供试菌株的DNA进行特异性检测，通过优化反应体系中各试剂用量及退火温度，建立PCR扩增最佳反应条件：反应体系加入量DNA（50 ng/μL）1 μL，特异引物对（10 pmol/μL）1 μL，dNTP（2.5 mmol/L）1 μL，10×Buffer 2.5 μL，Taq酶0.3 μL，ddH₂O 18.2 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性45 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，72 ℃延伸完全10 min，4 ℃下保存。将供试菌株的DNA浓度分别稀释为30 ng/μL、20 ng/μL、10 ng/μL、5 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL和1 pg/μL，按照上述反应条件和程序进行PCR扩增，以ddH₂O作为阴性对照。

2  结果与分析

2.1多主棒孢Cassiicolin基因条形码数据库的构建

根据菌株地理来源、寄主、年份和毒素类型等信息，挑选了287株代表性菌的Cassiicolin基因序列上传至NCBI数据库，构建了国内主要热带作物多株棒孢的Cassiicolin条形码数据库（表1）。基于NCBI公共数据库已公布的多主棒孢Cassiicolin基因信息，分别使用BLAST方法和MJ系统发育树法与NCBI数据库已公布的多主棒孢Cassiicolin条形码序列进行比对，共同构建系统发育树（图1）。结果发现，供试的多主棒孢菌株与NCBI已公布的多主棒孢Cassiicolin序列同源性均高达99%，第Ⅰ大類群是Cas5型，均为橡胶树多主棒孢，主要来源于云南、海南、广东、广西等国内橡胶主产区，还有部分菌株来源于越南、柬埔寨、马来西亚。第Ⅱ大类群是Cas2型，是橡胶和其他作物均有的多主棒孢，主要来源于橡胶树、木薯、黄瓜、番木瓜、大豆、棉花等，不同寄主上的菌株亲缘关系近，都聚类到一个分支上。从系统发育树的结果可以看出，不同毒素类型的多主棒孢菌株与寄主来源密切相关，但与地理来源没有明显的相关性，且Cas5型的多主棒孢仅为橡胶树所特有，为我国橡胶树多主棒孢的优势种群。

2.2Cassiicolin毒素基因的分子检测

本研究对我国橡胶主产区以及主要热带作物上分离保存的919株多主棒孢病菌进行Cassiicolin毒素基因检测。发现我国多主棒孢病菌仅存在2种毒素类型，分别是Cas5型和Cas2型，其中Cas5型的菌株占94.8%，为国内橡胶树主产区多主棒孢病菌的优势种群，且为橡胶树所特有。而Cas2型是橡胶树和其他作物（如：番木瓜、木薯、黄瓜等）多主棒孢共有的毒素类型，占3.2%。另一部分菌株未检测到Cassiicolin毒素基因，定为Cas0型，占2%，在供试菌株中均未检测到Cas1、Cas3、Cas4和Cas6型毒素基因的菌株（图2）。

用Cassiicolin（Cas5/Cas2）引物进行特异性检测，分别对壳梭孢（HNrMLXY1601）、茄类镰刀菌（FsHHNBS04）、尖孢镰刀菌（Foc4）、胶孢炭疽菌（Hbcg01）、尖孢炭疽菌（YN26-2）进行分子检测。从图3和图4的扩增检测结果可以看出，Cas5-F/Cas5-R和Cas2-F/Cas2-R特异引物对仅能从供试多主棒孢菌株中扩增到目的条带，约750 bp，其他对照菌株和阴性对照均无任何扩增产物，并且Cas5-F/Cas5-R引物仅能扩增得到多主棒孢Cas5型毒素基因，Cas2-F/Cas2-R引物亦如此，具有唯一性说明这两对引物对多主棒孢菌株有较强的特异性，可以用于多主棒孢病菌的分子检测（图3，图4）。

用Cas5-F/Cas5-R和Cas2-F/Cas2-R进行引物的灵敏度检测，分别对Cas5型菌株HCcYN49和Cas2型菌株PaCcSD02进行梯度扩增，使其DNA浓度为30 ng/μL、20 ng/μL、10 ng/μL、5 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL和1 pg/μL时进行扩增，并设置阴性对照。扩增结果显示，

30 ng/μL～100 pg/μL浓度的多主棒孢病菌DNA均可扩增到约750 bp的特征条带，对照物无扩增条带，Cas5-F/Cas5-R和Cas2-F/Cas2-R均可以检测到100 pg/μL及以上浓度的目标基因组DNA，可用于多主棒孢病菌的快速检测（图5）。

左图为特异引物Cas5-F/Cas5-R的扩增结果，右图为特异引物Cas2-F/Cas2-R的扩增结果。

The left picture is the amplification result of the specific primer Cas5-F/Cas5-R and the right one is the amplification result of the specific primer Cas2-F/Cas2-R.

1：30 ng/μL;2：20 ng/μL;3：10 ng/μL;4：5 ng/μL5：1 ng/μL;6：100 pg/μL;7：10 pg/μL;8：1 pg/μL;9：阴性对照（negative control）;M：DL2000 DNA marker。

3  讨论

DNA条形码是生物基因组中普遍存在的、较短的、标准化的DNA序列，它具有稳定的种内保守性，又包含足够的种间遗传变异，实现了对物种的快速而准确的鉴定^[12]。相比于传统的形态学鉴定，DNA条形码技术不受个体发育阶段、完整性等方面的影响，可以一次性快速鉴定大量的样本，极大的促进了生物分类学、生物多样性以及分子系统学等领域的研究^[13]。Cassiicolin毒素基因是多主棒孢基因组中一段公认的、特有的、相对较短的DNA序列，能将多主棒孢与其他真菌进行有效区分，实现精准鉴定。在多主棒孢生理小种尚未定论的情况下，国际上常利用Cassiicolin基因编码的6个毒素类型作为多主棒孢种内和种间遗传结构、种群变化以及致病类型的主要依据^[14]。本研究基于Cassiicolin基因，构建了含287个菌株的国内主要热带作物多主棒孢基因条形码数据库，建立了多主棒孢早期分子检测技术，分析了919株多主棒孢的毒素类型，发现我国多主棒孢病菌仅存在2种毒素类型，分别是Cas5型和Cas2型，其中Cas5型为国内橡胶树主产区多主棒孢病菌的优势种群，且为橡胶树所特有，而Cas2型是橡胶树和其他作物（如：番木瓜、木薯、黄瓜等）多主棒孢共有的毒素类型。在供试的多主棒孢菌株中均未检测到Cas1、Cas3、Cas4和Cas6型毒素基因的菌株。据Déon等^[5]研究发现，Cas1型菌株主要是非洲国家橡胶树和其他作物共有;Cas2和Cas6型菌株来源于国外其他寄主植物（非橡胶）;Cas3和Cas4型均来自巴西的橡胶树内生多主棒孢菌株;Cas5型菌株则来源于中国、马来西亚、柬埔寨、斯里兰卡等亚洲国家橡胶树。尽管Cas5型为我国橡胶多主棒孢的优势种群，但Cas2型只有在我国的橡胶树上发现，其他国家的Cas2型只有在非橡胶的其他寄主植物多主棒孢上存在。目前，有关多主棒孢Cassiicolin毒素类型与致病性之间的关系尚未得到广泛的研究，尤其是毒素类型与寄主专化性、致病力强弱、生物学特性、形态学以及症状类型之间的关系值得在今后的研究中深入开展。另外，在多主棒孢生理小种尚未明确的情况下，Cassiicolin毒素基因有助于对多主棒孢潜在的种内或种间遗传进化关系的解析，特别是那些还没有确认Cassiicolin毒素类型的Cas0型菌株，可能是多主棒孢新的种群。

DNA条形码分析方法有5种^[12]，本研究采用了系统发育树的分析方法，构建了多主棒孢基因条形码序列的系统发育树，在系统发育树上形成了2个大的遗传类群，分别是Cas5类群和Cas2类群，与分子检测结果一一对应，各分枝与毒素类型相一致。系统发育树的DNA条形码分析法在一定程度上反映了物种的亲缘关系，但由于不完全谱系分类、祖先多态性及物种旁系同源性等原因，某些物种在系统发育树上不能形成单系，但本研究构建的多主棒孢Cassiicolin基因的系统发育树没有出现由于种内遗传距离小，在系统发育树上常形成嵌套关系的现象。而且相比于其他几种DNA条形码的分析方法，系统发育树法摆脱了遗传距离阈值等影响，只考虑序列内部的特征核苷酸，不涉及系统发育关系，在近缘种的鉴定上也表现出一定的优势。通过系统发育树进一步分析发现橡胶多主棒孢单独成为一个类群，与其他寄主的多主棒孢菌株存在明显的差异，但不同地理来源的菌株间无明显差异。致病力分化分析显示^[9]，橡胶多主棒孢菌株不能侵染其他寄主，存在明显的寄主专化性现象，由于多主棒孢病菌寄主范围广，不同毒素类型结构上的差异导致病原菌在致病性和寄主专化性上存在明显差异。

综上所述，本研究首次构建了国内主要热带作物多主棒孢Cassiicolin基因条形码数据库，建立了基于Cassiicolin基因的多主棒孢早期分子检测技术，系统分析了我国橡胶树、木薯、番木瓜、瓜菜等主要热带作物多主棒孢的毒素类型，明确了国内多主棒孢的种群结构、优势种群和特有毒素类型。本研究为明确我国主要热带作物多主棒孢病菌的种群遗传结构和优势种群情况，发掘、保存多主棒孢菌种资源以及制定病害的防治策略上具有重要意义。

参考文献

• 高  苇， 李宝聚， 石延霞. 多主棒孢菌在黄瓜、番茄和茄子寄主上致病力的分化[J]. 园艺学报， 2011， 38（3）： 465-470.
• 高宏华， 罗大全， 黄贵修. 巴西橡胶树棒孢霉落叶病概述[J]. 热带农业科学， 2008， 28（5）： 19-24.
• 王  爽， 孔祥义， 林春花， 等. 豇豆轮纹病病原鉴定及其室内药剂筛选[J]. 热带农业科学， 2012， 32（5）： 61-65.
• 王  爽， 黄贵修， 李博勋， 等. 甜瓜棒孢叶斑病病原菌鉴定及其生物学特性研究[J]. 热带作物学报， 2013， 34（12）： 2446-2452.
• Déon M， Fumanal B， Gimenez S. Diversity of the Cassiicolin gene in Corynespora cassiicola， and relation with the pathogenicity in Hevea brasiliensis[J]. Fungal Biology， 2014，

118（1）： 32-47.

• Atan S， Hamid N H. Differentiating races of Corynespora cassiicola using RAPD and ITS markers[J]. Journal of Rubber Research， 2003， 6（1）： 58-64.
• Shukor N A A， Atan S， Derapi S， et al. Screening susceptibilty of Hevea progenies from PB 5/51 XIAN 873 to two races of Corynespora cassiicola[J]. Journal of Rubber Research， 2011， 14（2）： 110-122.
• Déon M， Bourré Y， Gimenez S， et al. Characterization of a cassiicolin-encoding gene from Corynespora cassiicola， pathogen of rubber tree （Hevea brasiliensis）[J]. Plant Science， 2012， 185-186（4）： 227-237.
• 劉先宝， 李博勋， 陈  珊， 等. 国内橡胶树多主棒孢Cassiicolin毒素多样性及致病性分析[J]. 热带作物学报， 2016， 37（10）： 1969-1973.
• 方中达. 植病研究方法[M]. 3版. 北京：中国农业出版社，1998： 46.
• 刘先宝， 蔡吉苗， 潘羡心， 等. 橡胶树多主棒孢菌rDNA-ITS区的分子鉴定及检测[J]. 热带作物学报， 2008， 29（4）： 489-493.
• 杨倩倩， 刘苏汶， 俞晓平. DNA条形码分析方法研究进展[J]. 应用生态学报， 2018， 29（3）： 1006-1014.
• Hebert P D N， Cywinska A， Ball S L， et al. Biological identifications through DNA barcodes[J]. Proceedings of the Royal Society B， 2003， 270（1512）： 313-321.
• David L， Ribeiro S， Philippe L， et al. Genome-Wide analysis of Corynespora cassiicola leaf fall disease putative effectors[J]. Frontiers in Microbiology， 2018， 9： 276.