灯盏花成分专用型种源评价与鉴定

李锐 刘冠泽 卢迎春 杨建文 关德军 杨生超

摘  要  收集和鑒定了云南省和贵州省共46份灯盏花种质资源，筛选出适合生产不同药品的成分专用型种源，为专用型品种选育提供参考。利用HPLC测定了灯盏花种源10种活性成分含量，相关分析阐明各成分含量间的相关性，聚类分析对种质资源进行分类。结果表明：16份灯盏花种源灯盏乙素（scutellarin， SE）含量在2.5%以上，是培育灯盏花素专用型品种的优良材料，其中4份种源同时含有高含量（>1.0%）的双咖啡酰奎宁酸酯（dicaffeoylquinic acids， diCQAs），是培育灯盏细辛专用型品种的优良材料;同时，筛选出8份总黄酮（total flavonoids， TFs）含量高于3.5%的种源，适合选育总黄酮专用品种。相关性分析表明，SE含量与diCQAs和TFs含量均显著正相关，是灯盏花品质育种的标志性成分。聚类分析将灯盏花种源分为三大类，除1个种源的SE含量和diCQAs含量接近（第Ⅲ类）外，其他种源SE均占总活性成分的60%以上，其中第Ⅰ类为高TFs型种源，TFs占到总活性成分的80%以上，diCQAs占总成分的15%以下;第Ⅱ类为高diCQAs型种源，diCQAs占总成分的16.9%～28.9%，TFs占到总活性成分的80%以下。该结果表明灯盏花种源活性成分组成存在多种类型，为专用型品种选育提供了可能，灯盏乙素含量可以作为专用型种源筛选的首要指标。

关键词  灯盏花;专用型种质资源;灯盏乙素;相关性分析中图分类号  S31      文献标识码  A

Evaluation and Identification of Special Composition Germplasms in Erigeron breviscapus

LI Rui^1，2， LIU Guanze^1，2， LU Yingchun^1，2， YANG Jianwen³， GUAN Dejun²， YANG Shengchao^1，2*

1. National & Local Joint Engineering Research Center on Germplasm Innovation & Utilization of Chinese Medicinal Materials in Southwestern China， Kunming， Yunnan 650201， China; 2. Key Laboratory of Medicinal Plant Biology of Yunnan Province， Yunnan Agricultural University， Kunming， Yunnan 650201， China; 3. Yunnan Hongling Biotechnology Co.， Ltd.， Luxi， Yunnan 652499， China

Abstract  Forty sixErigeron breviscapusgermplasms were collected from Yunnan and Guizhou provinces， and the active constituents were determined for selecting special composition germplasms. Ten active constituents in the germplasms were determined by HPLC （high performance liquid chromatography）， the relationships among the contents of different active constituents were revealed by correlation analysis， and the germplasms were classified into different groups by cluster analysis according to the composition of active constituents. Sixteen germplasms with a content of scutellarin （SE） more than 2.5% were the ideal materials for breeding breviscapine-type cultivars， among them， four germplasms with a content of dicaffeoylquinic acids （diCQAs） more than 1% were suitable for breeding Dengzhanxixin-type cultivars. Furthermore， eight germplasms with total flavonoids （TFs） more than 3.5% were suitable for breeding flavone-type cultivars. The content of SE was positively correlated with the contents of diCQAs and TFs， indicating that SE was the selective marker for quality breeding inE. breviscapus. Most germplasms were included in two clades （I and II） by cluster analysis， except one germplasm， which containing equal contents of SE and diCQAs （III）. The first clade （I）， designed as high TFs-type germplasms， contained higher TFs relative content （more than 80%） and lower diCQAs relative content （less than 15%）， while the second clade （II） were characterized by high relative contents of diCQAs （16.9%-28.9%） and lower TFs relative content （less than 80%）.

Keywords  Erigeron breviscapus; special composition germplasms; scutellarin; correlation analysis

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.09.007

灯盏花[Erigeron breviscapus （Vant.） Hand-Mazz.]为菊科飞蓬属植物，主要分布于我国云南、四川、贵州、广西、西藏、湖南等西部和西南部海拔1200～3500 m的中山和高山开阔山坡草地、林缘或疏林下，具有散寒解表、祛风除湿、舒筋活血、消积止痛等功效^[1]。灯盏花是云南的道地药材之一，采集量约占全国的95%^[2]。灯盏花主要活性成分灯盏花素（breviscapine）属于黄酮糖苷类化合物，主要是灯盏乙素（scutellarin， SE）和少量的灯盏甲素（apigenin-7-O-glucronide， APG），是治疗闭塞性脑血管疾病和脑溢血后遗症的天然特效药物^[3]，能夠降低外伤性脑损伤、脑缺血/再灌注损伤和缺氧缺血性脑损伤等造成的神经元损伤^[4-7]，对糖尿病肾病具有疗效^[8]。灯盏花的另一类活性成分为二咖啡酰奎宁酸酯（dicaffeoylquinic acids， diCQAs），主要包括1，3-O-二咖啡酰奎宁酸（1，3-diCQA），3，5-diCQA，4，5-diCQA和飞蓬酯乙（erigoster B， EB）等，具有与灯盏乙素相似的生物活性^[9-12]。

目前，以灯盏花为原料的中成药全国共有18种，适应症主要集中在心脑血管领域。以灯盏花活性成分为主的药品包括三大类，第一类药品仅含灯盏花素，或其主要成分SE，如注射用灯盏花素、灯盏花素注射液和灯盏花素片等。第二类药品同时含有灯盏花素（主要是SE）和多个diCQAs单体，如灯盏细辛注射液、灯盏生脉胶囊、灯盏细辛胶囊等;第三类药品以总黄酮（total flavones， TFs）为主要成分，如益脉康胶囊等。因此，需要根据不同的药品需要，分别选育灯盏花素专用型、灯盏细辛专用型和总黄酮专用型新品种。

随着野生资源的日益枯竭^[13]，人工栽培已经成为灯盏花药材的主要来源。目前，云南省集中了我国98%的灯盏花种植和80%的活性成分提取，人工选育成分专用型品种势在必行。课题组在种质资源收集的基础上，曾成功选育了两个灯盏花新品种“千山1号”和“千山2号”^[14-15]，这2个品种都具有高产、高灯盏乙素（超过2.5%）的特点，已经成为云南省灯盏花的主栽品种，累计种植面积超过2.67×10⁸m²，取得了显著的经济效益。但是，目前生产上尚无灯盏细辛专用型和总黄酮专用型灯盏花品种。同时，灯盏花种子细小、世代周期短，品种极易退化，而且其严格的自交不亲和性也容易引起品种的混杂退化，因此，需要不断筛选优良野生种源，培育成分专用型新品种以满足药材生产的需求。本研究收集和鉴定了云南省和贵州省共46份灯盏花种质资源，以筛选出适合生产不同药品的成分专用型种源，为专用型品种选育提供参考。

1  材料与方法

1.1 材料

1.1.1灯盏花种质资源收集  46份灯盏花种质分别收集于云南省12个地州市，以及贵州六盘水市等地区（表1），其中云南省44份，主要来自于红河州（8份）、大理州（7份）、昆明市（6份）、曲靖市（5份）、丽江市（4份）、玉溪市（3份）、文山州、保山市、宣威市和昭通市各2份，怒江州和楚雄州各1份，与云南省毗邻的贵州省六盘水市2份。采集的野生灯盏花植株栽植于云南红灵生物科技有限公司，建立种质资源圃。

1.1.2  试剂  灯盏花10种活性成分包括咖啡酸（caffeic acid， CA），绿原酸（chlorogenic acid， CGA），SE，1，5-diCQA，3，5-diCQA，4，5-diCQA，3，4-diCQA，EB，APG，野黄芩素（scutellarein， SA），均购自中国科学院成都生物研究所，纯度大于98%，用于标准曲线绘制及其含量测定用。乙腈（HPLC级，Cisher）为色谱纯，甲醇（HPLC级，Fluka）为色谱纯和分析纯，磷酸（HPLC级，Fluka）为分析纯，水为纯净水。

1.2 方法

1.2.1  样品采集和处理  种质资源圃内灯盏花种源初花期时，五点取样法随机选取30株，60 ℃烘干作为一个样品，每份种源重复3次。参考2015年版《中国药典》第一部对灯盏花样品溶液制备方法，将干燥后的植物材料研磨成粉用于活性成分含量测定。精密称量0.5 g研磨样品，加入70%甲醇50 mL，超声波提取（功率180 W，频率40 kHz）30 min，0.22 μm的微孔滤膜过滤，滤液用于HPLC检测。

1.2.2  HPLC检测方法  试验采用Agilent ZOR BAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，2.7 μm）色谱柱，流动相为0.2%磷酸+5%乙腈溶液（A）0.2%磷酸+40%乙腈+40%甲醇溶液（B），梯度洗脱0～0.2 min，5% B;0.2～20.0 min，20% B;20.0～20.5 min，100% B;20.5～25.0 min，100% B;25.0～25.5 min，5% B;检测波长为335 nm，进样体积10 μL，流速1.0 mL/min，柱温为40 ℃。以10个对照品含量为横坐标，所对应的峰面积为纵坐标绘制对照品标准曲线，用于含量测定。

1.3数据处理

采用Excel 2016软件计算各化合物性状的标准差、平均值和变异系数;应用SPSS 20.0软件对数据进行相关性分析、聚类分析，其中聚类分析采用Ward法。

2  结果与分析

2.1 灯盏花种源活性成分含量分布

本研究共检测了灯盏花种源中的10种活性成分，包括3个黄酮类物质（SE、APG和SA），5个diCQA单体（1，5-diCQA、3，5-diCQA、4，5-diCQA、3，4-diCQA和EB）和2种有机酸（CA和CGA）。灯盏花种质资源中SE的含量最高，其次是EB，APG和3，5-diCQA，其他成分的含量均较低（表2）。灯盏花主栽品种‘千山1号和‘千山2号是由红河州个旧市（HHGJ）的野生种源选育而来，因此本研究中以其作为对照来筛选优良种源。显著性分析发现，20份种源的SE含量显著高于HHGJ，其中16份种源的SE含量高于2.50%，是培育灯盏花素专用型品种的优良材料，其中4份种源同时含有高含量（>1.0%）的diCQAs，是培育燈盏细辛专用型品种的优良材料。同时，筛选出8份TFs含量高于3.5%的种源，适合选育总黄酮专用品种（表3）。

2.2灯盏花活性成分含量的相关性分析

SE是灯盏花的最主要药效成分，本研究发现SE含量与CA、EB、4，5-diCQA、SA、di-CQAs、TFs、Total呈显著正相关，与3，5-diCQA、APG呈负相关;di-CQAs与CA、SE、EB、4，5-diCQAs呈显著正相关;TFs与CA、SE、EB、4，5-diCQAs、SA、di-CQAs呈显著正相关。育种中可以将SE作为3种专用型品种的标记成分（表4）。

2.3 灯盏花种质资源组分相对含量的聚类分析

根据各成分的相对含量（占总活性成分含量的百分比）（表5），对种质资源进行了聚类分析发现，当欧氏距离为20时，46份灯盏花种源分为三大类，除1个种源的SE含量和diCQAs含量接近（第Ⅲ类）外，其他种源SE均占总活性成分的60%以上，其中第Ⅰ类为高TFs型种源，TFs占到总活性成分的80%以上，diCQAs占总成分的15%以下;第Ⅱ类为高diCQAs型种源，diCQAs占总成分的16.9%～28.9%，TFs占到总活性成分的80%以下（图1）。

其中第Ⅰ类又可分为A、B两个亚类，其中A亚类为高SE，低APG，其SE相对含量在70%左右，APG在15%以下;B亚类SE相对含量在60%以上，APG在所有类群中所占比重最高，达15%以上。第二类包含C、D、E、F、G、H 5个亚类，其中C亚类SE占比在58%左右，4，5-diCQAs所占比重最高，达2.9%以上，diCQAs所占比重达24%以上。D亚类SE占比在59%左右，EB在所有类群中所占比重最高，为17.3%以上;diCQAs所占比重也最高，达26%以上。G亚类的显著特点是3，5-diCQA所占比重最高，高达9%以上。H亚类APG在第二大类群中APG比重是最高的，达12.9%以上。

3  讨论

种质资源是遗传育种的基础。本研究全面收集了包括云南省和贵州省共计46份灯盏花种质，其中保山地区和怒江地区的灯盏花种质资源是首次收集到，在灯盏花处于初花期时进行样品采集^[16]，并进行了10种主要化合物的含量测定，高效检测方法的建立为种源评价和成分间相关性研究提供了基础。由于灯盏花是广布种，本研究所采集到的灯盏花种源地理距离较大，而且不同分布区生态地理的差异、地理隔离以及具体生境的差别，长期的自然选择，致使不同分布区或生境的灯盏花在形态、生理、遗传、生态习性等方面出现较大的分化，甚至形成了生态型^[17]。

在本次测定的46份灯盏花种质资源中10种主要化合物均存在明显差异，地理上相距较远的种质间有效成分含量差异明显，地理上相近的种质资源间仍存在较大差异，这与先前研究结果相似^[15]。同时灯盏花具有严格的自交不亲和性^[18]，这也就导致了不同种源之间成分含量差别较大。前人研究表明，灯盏花素与diCQA两类成分含量为正相关关系^[19]，通过各成分相关性分析显示，SE含量与CA、EB、4，5-diCQA、SA、diCQAs、TFs显著正相关。这与前人研究一致，但是上述研究仅检测了少数几个组分，对更多单体组分间的相关性则缺乏了解，本研究较为全面对其进行相关性分析。在进行聚类分析后发现46个群体间根据化学成分表现出明显的聚类模式，但这种聚类模式跟地理并无明显关联规律，如高海拔地区成分之间仍然存在较大差异。Li等^[20]发现高纬度地区的气候可显著提高1，5-diCQA的产量，在本研究的测定结果中，1，5-diCQA含量均处于较低水平，并且和海拔无明显的关联。因此，各成分与地理之间相关性还需进一步研究。

随着灯盏花药用价值的不断开发利用，其需求量也随之不断增长，目前只有‘千山1号和‘千山2号2个灯盏花品种的灯盏乙素含量达到2.50%以上，并且在云南省有较大种植面积，但是这两个品种其余活性成分的含量较低;在实际生产应用中，除了灯盏乙素之外还需要用到其他活性成分，这就需要多种活性成分含量更高的品种。同时灯盏花种源活性成分组成存在多种类型，这也为专用型品种选育提供了可能，灯盏乙素作为灯盏花中最主要活性成分，可以作为专用型种源筛选的首要指标。本研究在对野生灯盏花种质资源收集并保存的基础上进行主要含量测定，初步筛选出针对特定药用需求的优质灯盏花种源，为日后灯盏花野生种质资源的选择和培育指明方向。

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