Na2SeO3对药食用真菌蛹虫草子实体生长及功能成分腺苷、虫草素的影响

马麦艳，张相锋，马正海，焦子伟

(1.新疆大学生命科学学院，乌鲁木齐 830046；2.伊犁师范大学生物与地理科学学院，新疆伊宁 835000)

0 引 言

【研究意义】我国是世界上主要的硒资源国之一，但仍然是缺硒大国，2/3的地区存在不同程度的缺硒[3]。人体通常通过生物转化的方式来补硒[4,5]。真菌具有较强的生物富集和转化能力，可以将无机物转化为有机物。蛹虫草(Cordycepsmilitaris)是一种和冬虫夏草相媲美的药食两用真菌，且具有良好的富硒能力[6,7]。鉴于不同地区蛹虫草生物学特性会有一些差异性，因此，对新疆蛹虫草生物富硒进一步研究，为开发天然富硒蛹虫草提供技术支持。【前人研究进展】食用菌作为富硒载体，其效果较好，如今在我国正被广泛应用，目前已培育出富硒灵芝、富硒金针菇、富硒平菇等产品[8-11]。在生物载体方面，而关于富硒蛹虫草的研究相对较少，于田田等[12]研究生物富硒对人工蛹虫草菌丝体中粗脂肪、粗蛋白、总灰分、虫草素、腺苷、虫草酸及虫草多糖等多种功效成分含量均有显著影响。凌宏通等[13]研究表明,硒可提高蛹虫草的耐硒能力，但加过量硒源会导致蛹虫草分化时间延长和子座产量降低。【本研究切入点】不同地区蛹虫草生物学特性会有一些差异。以亚硒酸钠(Na2SeO3)作为外源硒，新疆地区蛹虫草为富硒载体，采用不同硒浓度培养液对蛹虫草进行人工栽培处理，研究蛹虫草对亚硒酸钠的耐受性。【拟解决的关键问题】系统研究不同浓度亚硒酸钠处理对蛹虫草菌丝、子座、子实体生长，产量、总硒及其功能成分腺苷、蛹虫草含量的影响，研究富硒蛹虫草栽培最佳适宜的浓度，为大面积人工栽培富硒蛹虫草提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试菌株

供试菌株为不同交配型MAT1-1和MAT1-2代表菌株d9、a11，来源于实验室。

1.1.2 供试培养基

改良PDA固体培养基、改良PD液体培养基[14]。

含硒培养液：在配好的改良PD液体培养基中分别加入一定量的Na2SeO3，分别配成硒浓度为20、40、60、80、100、150和200 mg/L含硒培养液。

大米培养基：每个组培瓶中加入20 g大米和20 mL不同浓度含硒改良培养液，盖紧瓶盖，于115℃高压蒸汽灭菌15 min。

1.2 方 法

1.2.1 试验设计

试验共设计8个处理，每个处理重复3次。表1

表1 不同处理人工栽培培养基
Table 1 Artificial media ingredents of different treatments

处理Treatments人工培养基配方Artificial cultivation medium ingredients 1大米 20 g/瓶+20 mL/瓶(20 mg/L)浓度的含硒培养液2大米 20 g/瓶+20 mL/瓶(40 mg/L)浓度的含硒培养液3大米 20 g/瓶+20 mL/瓶(60 mg/L)浓度的含硒培养液4大米 20 g/瓶+20 mL/瓶(80 mg/L)浓度的含硒培养液5大米 20 g/瓶+20 mL/瓶(100 mg/L)浓度的含硒培养液6大米 20 g/瓶+20 mL/瓶(150 mg/L)浓度的含硒培养液 7大米 20 g/瓶+20mL/瓶(200 mg/L)浓度的含硒培养液8(CK)大米 20 g/瓶+20 mL/瓶不含硒的改良培养液

1.2.2 蛹虫草栽培

人工栽培参照努尔买买提等[14]的方法进行。

将MAT1-1，MAT1-2两个菌株接种于改良PDA培养基培养15～20 d进行活化。将活化后的两种菌种分别接种在改良PD液体培养基中，获得d9、a11两种菌悬液。将这两种菌悬液等体积混合均匀后用无菌水稀释10倍，吸取10 mL均匀添加到各个处理的培养瓶中，放置培养室进行培养，培养期间人工定期对培养室进行消毒擦洗，在室内相对湿度(80%)、温度(25 ± 1)℃和光照16 h条件下培养55～60 d。

1.2.3 蛹虫草子实体生物量的测定

定期对不同浓度亚硒酸钠处理的蛹虫草子菌丝体及子实体生长状况进行观察、记录；将在不同培养基上培养55～60 d的蛹虫草子实体进行采收。并对采收的蛹虫草子实体的长度、干重、鲜重、生物转化率、硒含量及主要功能成分等相关指标进行测定。

1.2.4 蛹虫草子实体中硒含量检测

蛹虫草子实体中硒含量检测方法参照蔡宝祥等方法[15]。

1.2.5 蛹虫草子实体中腺苷、虫草素含量检测

采用高效液相色谱法进行检测[16]。

测定条件∶C18∶250 mm×4.6 mm×5 μm；流动相∶A∶乙腈B∶1.0%乙酸，A∶B(v/v)=5∶95；流速：1.0 mL/min，柱温：35℃，检测波长：260 nm，进样量：10 μL。

标准溶液配制：取虫草素、腺苷标准品各10 mg(按实际含量折算)，用流动相(乙腈∶水(v/v)为5∶95)定容至100 mL(100 μg/mL)，充分摇匀。

标准曲线绘制：配制不同梯度的虫草素和腺苷标准品溶液，分别取0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL标准溶液定容至10 mL，标准曲线浓度1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/mL。将待测提取液逐一进高效液相色谱仪进行检测，根据标准曲线计算其虫草素和腺苷的含量。

1.3 数据处理

采用SPSS软件(Version 11.5，USA)、EXCEL软件对数据进行方差分析(ANOVA)。

2 结果与分析

2.1 蛹虫草菌丝生长

研究表明，经接菌、人工栽培后，不同浓度Na2SeO3处理与对照相比，处理1和处理2中的蛹虫草菌丝体生长状况最好，接种后4 d，菌丝已布满整个培养基基质，且菌丝密度最好，菌丝转成橘黄色速度最快，10～11 d菌饼变黄；其它处理的蛹虫草菌丝生长情况不尽一致。处理3、处理4与对照处理相比，对蛹虫草菌丝体生长有轻微的抑制作用，菌饼变黄用时14 d，菌丝密度较好，菌丝转色较快；而处理5(硒浓度100 mg/L)对蛹虫草菌丝体生长具有明显的抑制作用，菌丝转色速度较慢，且菌饼变黄用时19 d；处理7(硒浓度200 mg/L)蛹虫草菌丝生长情况最差，抑制最强，菌丝长满培养基用时19 d，菌饼变黄用时33 d，且菌丝密度最差，菌丝转成橘黄色速度最慢。硒浓度≤40 mg/L时对蛹虫草菌丝体生长无影响，但随着硒浓度的不断增加，对其菌丝体生长抑制越强。表2

表2 不同处理蛹虫草的菌丝生长比较
Table 2 Comparison on growth of hypha inCororcepsrnitarisserved as different treatments

处理Treatments菌丝长满时间Mycelia overgrown time (d)菌丝密度Mycelia density菌丝转色Mycelia color transformation菌饼变黄时间Media colour transformation (d)14++++白色变橘黄色快1024++++白色变橘黄色快113 6+++白色变橘黄色较快1446+++白色变橘黄色较快1459+++白色变橘黄色较慢19611++白色变橘黄色慢24719+白色变橘黄色最慢338(CK)4++++白色变橘黄色快11

注：“++++”密度最好；“+++” 密度较好；“++” 密度一般； “+”密度差

Note: “++++” indicates the best density; “+++”indicates better density; “++” indicates ordinary density; “+”indicates poor density

2.2 蛹虫草子实体生长

研究表明,不同处理的蛹虫草子实体生长状况及各项生物学指标各不相同。与对照相比，处理1、处理2表现最好，蛹虫草子实体形成时间最早，为27 d，子座粗长、均匀，子实体正常、橘红色，有子囊壳，且出草质量最好；处理3、处理4对蛹虫草子实体生长仅有轻微的抑制作用，这两个试验组的蛹虫草各项生物学指标均表现较好，出草时间较早，用时29 d，子座较粗长、均匀，子实体较正常、橘红色，有子囊壳，出草质量较好；处理5(硒浓度100 mg/L)时，对蛹虫草子实体生长具有明显的抑制作用，出草时间为33 d，子座粗短，出草较晚，且出草质量较差；Na2SeO3浓度为150 mg/L的试验组次之；处理7(硒浓度200 mg/L)蛹虫草子实体生长及各项生物学指标表现最差，仅少量出草，且细短，出草最慢，有子囊壳，出草质量最差。硒浓度≤40 mg/L时对蛹虫草子座、子实体生长无影响但随着硒浓度的不断增加，对蛹虫草子座、子实体生长抑制越强。表3

表3 不同处理蛹虫草的子实体生长比较
Table 3 Comparison on growth of fruitbody inCororcepsrnitarisserved as different treatments

处理Treatments出草时间Formation time of fruiting-body子座生长Stromata formation子实体生长及色泽Fruiting-body growth and colour子囊壳Ascocarp出草质量Fruiting-body Quality127子座粗长,均匀出草早,正常,橘红色有+++227子座粗长,均匀出草早,正常,橘红色有+++3 29子座较粗长,均匀出草较早,较正常,橘红色有++429子座较粗长,均匀出草较早,较正常,橘红色有++533子座粗短,均匀出草较晚,较差,橘红色有+635子座粗短,均匀出草较晚,较差,橘红色有+742子座较细短,不均匀出草最晚,最差,仅部分出草,橘红色有-8(CK)27子座粗长,均匀出草早,正常,橘红色有+++

注：“+++”表示80%的子实体直径≥3 mm，长度≥4 cm；“++”表示80%的子实体直径≥2 mm，长度≥3 cm；“+”表示80%的子实体直径≥1 mm，长度≥2 cm。“-”表示80%的子实体直径<1 mm，长度<2 cm

Note: “+++” means 80% of the fruitbody dimeter ≥3 mm, and length ≥4 cm; “+ +” means means 80% of the fruitbody dimeter ≥2 mm, and length ≥3 cm; “+” means 80% of the fruitbody dimeter ≥1 mm, and length ≥2 cm; “-” means 80% of the fruitbody dimeter <1 mm, and length <2 cm

2.3 蛹虫草出草比较

研究表明,不同处理对蛹虫草子实体生长状况有不同的影响。处理1、处理2与对照相比对蛹虫草子实体无影响，长势最好，子实体粗长、均匀，色泽鲜艳；处理3、处理4对蛹虫草子实体生长具有轻微的抑制作用，蛹虫草长势较好；处理5和处理6对其抑制作用较明显，蛹虫草子实体长势较差；处理7(硒浓度200 mg/L)对蛹虫草子实体生长影响最大，长势最差，仅少量出草，且细短，不均匀。图1

处理1和处理2两个处理与对照相比对蛹虫草子实体的长度、鲜重、干重、生物转化率等方面无显著差异(P<0.05，下同)；处理2的蛹虫草子实体鲜重最高，为8.94 g，生物转化率44.68%。处理3至处理7与对照相比对蛹虫草的鲜重、干重、生物转化率等方面均呈显著性差异；处理3当硒浓度达到60 mg/L，蛹虫草的除鲜干比以外其他指标明显低于对照，并呈显著性差异；处理7(硒浓度200 mg/L)的蛹虫草除鲜干比以外其他指标均表现最差，其处理的子实体长度3.48 cm，鲜重5.12 g，干重1.13 g，生物转化率最低，为25.30%。硒浓度≤40 mg/L时对蛹虫草子实体的鲜重、干重、生物转化率生长无影响，但随着处理硒浓度不断增加，对蛹虫草子实体的长度、鲜重、干重、生物转化率等降低越明显。表4

图1 不同处理人工栽培蛹虫草子实体效果
Fig. 1 Effects on fruitbody ofCororcepsrnitarisin artificial cultivation served as different treatments

表4 不同处理的蛹虫草子实体相关指标
Table 4 Relative index analysis of fruitbody inCororcepsrnitarisserved as different treatments

处理Treatments子实体长度 Fruitbody length (cm)鲜重 (g/瓶)Fresh weight (g/bottle)干重(g/瓶)Dry weight (g/bottle)鲜干比Fresh dry ratio生物转化率Biological conversion rate (%)15.88±0.09a8.82±0.24a1.74±0.04a5.24±0.10abc43.76±1.21a25.79±0.18a8.94±0.44a1.72±0.04a5.51±0.19a44.68±2.21a3 4.64±0.15c7.59±0.33b1.53±0.04b5.12±0.15abc37.74±1.60b44.65±0.10c7.42±0.26b1.47±0.03bc5.38±0.09ab37.12±1.28b54.05±0.11d7.10±0.16b1.51±0.04bc4.99±0.08bc35.17±0.82b64.14±0.09d6.73±0.18b1.40±0.01c5.09±0.15abc33.32±0.90b73.48±0.08e5.12±0.46c1.13±0.06d4.86±0.15c25.30±2.30c8(CK)6.12±0.14a8.70±0.18a1.80±0.03a5.10±0.11abc43.36±0.90a

注:数据为平均值和标准误差。(a-e)，不同字母表示为显著性差异(P< 0.05)，下同

Note: Data is the mean and standard error (a-e), and the different letters indicate significant differences (P< 0.05), the same as below

2.4 总硒含量检测

研究表明,处理1至处理7与对照相比，其处理的蛹虫草子实体中总硒含量均呈显著性差异(P<0.05，下同)。处理1和处理2相比，其子实体总硒含量无显著性差异，处理2的总硒含量最高，达31.2%；处理1、处理2与处理3、处理4、处理5、处理6、处理7之间相比，其总硒含量呈显著性差异。处理3和处理4的蛹虫草子实体中总硒含量差异不显著；但随着培养基中硒浓度的增加，蛹虫草子实体中总硒含量下降，处理7(硒浓度200 mg/L)的蛹虫草子实体中总硒含量最低，为4.01%。结果表明，处理1、处理2的蛹虫草子实体总硒含量最高，但随着硒浓度处理的不断增高，其子实体中总硒含量不断降低。表5

表5 不同处理子实体中总硒含量
Table 5 Total selenium content of fruiting body served as different treatments

处理 Treatments总硒含量Selenium content(%)130.70±0.28a231.20±0.32a326.74±0.47b422.68±0.19c522.45±0.47c618. 38±0.16d74.01±0.437e

2.5 功能成分腺苷、虫草素含量

研究表明，处理1、处理2与对照相比呈显著性差异(P<0.05，下同)，功能成分含量增加；处理1和处理2之间呈显著性差异，其中处理1的功能成分腺苷为1 409 μg/g，虫草素12 017.54 μg/g，最高。处理3至处理7与对照相比也呈显著性差异，随处理浓度不断增加其功能成分含量逐渐降低，以处理7的最低，为腺苷含量为593.64 μg/g，虫草素含量为4 235.89 μg/g。结果表明，硒浓度≤40 mg/L时对蛹虫草子实体的功能成分腺苷、虫草素的含量呈增加现象；但硒浓度≥60 mg/L时，随着硒浓度的增加其功能成分腺苷、虫草素的含量呈下降趋势。表6

表6 不同处理子实体中腺苷、虫草素含量
Table 6 contents of adenosine and cordycepin of fruiting body served as different treatments

处理Treatments腺苷Adenosine(μg/g)虫草素Cordycepin(μg/g)11 409.05±5.08a12 017.54±8.30a21 315.15±11.67b11 211.33±9.77b31 112.66±10.77c9 521.12±2.70d41 012.33±7.56d9 107.10±3.28e5924.40±4.93e6 808.12±4.66f6713.37±6.98f5 856.09±4.67g7593.64±6.45g4 235.89±5.33h对照组(CK)1 105.33±9.96c9 831.11±4.23c

3 讨 论

以新疆本地蛹虫草作为富硒载体，研究表明,各个不同浓度Na2SeO3处理对蛹虫草菌丝密度、菌丝长满时间、菌丝转色情况、菌饼变黄时间、子座生长、子实体的出草时间、子实体生长以及出草质量等各项生物学指标的影响各不相同。处理1(硒浓度20 mg/L)和处理2(硒浓度40 mg/L)与对照相比其蛹虫草的菌丝体生长、子座生长、子实体出草长度、鲜重、干重、生物转化率等方面无影响；从处理3(硒浓度60 mg/L)至处理7(硒浓度200 mg/L)与对照相比，其蛹虫草的菌丝体生长、子座生长受到抑制，其子实体出草长度、鲜重、干重、生物转化率等呈显著性差异(P<0.05)，呈降低趋势，并随着的硒浓度增加，抑制作用越明显，以处理7的最为严重，其处理的蛹虫草各项指标表现最差，即子实体长度3.44 cm，鲜重5.04 g，干重1.05 g，鲜干比为4.79，生物转化率最低，为25.22%。陈宏伟等[17]研究表明,较低硒浓度促进蛹虫草菌丝体生长，较高浓度硒抑制其菌丝生长；杜双田等[18]研究也表明,在蛹虫草菌株CM-003平板培养基上亚硒酸钠质量浓度≤100 mg/L时对蛹虫草的菌落形态基本正常，菌落直径变化较小；当亚硒酸钠质量浓度为450 mg/L时，其菌丝缓慢生长；随着亚硒酸钠质量浓度的增加，采用常规瓶栽法的蛹虫草的长势评分和子座产量呈先增加后减小现象。尽管和研究有一定的相似之处，但不同蛹虫草菌种资源及栽培条件等也影响其对亚硒酸钠耐受程度。此外，系统深入地研究了亚硒酸钠对其菌丝生长、子座生长、子实体生长、出草质量等定性指标，以及对其子实体长度、鲜重、干重和生物转化率等定量指标进行分析，明确了新疆本地蛹虫草菌种吸收亚硒酸钠较为理想的浓度。

杜双田等[18]研究表明,随着亚硒酸钠质量浓度的增加，子座硒含量呈逐渐增加趋势；亚硒酸钠质量浓度为200 mg/L时，子座硒含量92.68 mg/kg，最高。这与研究结果有差异，处理1、处理2的蛹虫草子实体总硒含量最高，但随着处理硒浓度不断增高，其子实体中总硒含量不断降低。处理1、处理2与对照相比其蛹虫草子实体的腺苷、虫草素含量明显增加。这与于田田等[12]研究结果相似，即生物富硒对蛹虫草菌丝体化学成分(营养和功效成分)含量有一定影响，富硒蛹虫草的腺苷、虫草素含量等明显高于普通蛹虫草。当亚硒酸钠浓度逐步增加时，子实体中的腺苷、虫草素含量逐渐下降，这可能是硒的存在对蛹虫草子实体代谢产生一定的影响，其影响机理有待进一步深入系统研究。

4 结 论

低浓度Na2SeO3对新疆地区蛹虫草的菌丝密度、菌丝长满时间、菌丝转色情况、菌饼变黄时间、子座生长、子实体出草时间、子实体生长、出草质量、子实体出草长度、鲜重、干重、生物转化率等方面无影响，其总硒含量较高和功能成分腺苷、虫草素含量增加；高浓度Na2SeO3抑制其生长、总硒含量较低和功能成分腺苷和虫草素含量下降。以亚硒酸钠作为外源硒，硒浓度20～40 mg/L效果最好，可作为进行蛹虫草富硒栽培较为理想的浓度。