肿瘤坏死因子-α 在慢性牙周炎中的研究进展*

刘 晨 毕良佳

慢性牙周炎作为一种常见的口腔类疾病，具有病程长、进展缓慢、发病率高等特点，是导致成人尤其是老年人牙齿拔除或脱落的主要原因之一。慢性牙周炎主要由革兰氏阴性细菌感染引起，这些细菌与宿主免疫系统之间复杂的相互作用可能诱发炎症，导致支持牙齿的胶原结构丧失。许多炎症介质，如白细胞介素-1(interleukin-1，IL-1)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白细胞介素-8(interleukin-8，IL-8)、TNF-α、PG 和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)等都会参与到牙周病的发生与发展过程中[1]，并可能影响白细胞、成骨细胞和破骨细胞的活性，促进全身和局部组织的重塑。胶原蛋白溶解酶(包括MMPs)由多种炎症细胞因子介导，如IL-1、IL-6、IL-8 和TNF-α[2]，其中TNF-α 作为慢性牙周炎的主要介质之一，被认为是参与牙周病发病的主要细胞因子，能够影响组织破坏的后果和牙周炎的严重程度。因此，明确TNF-α 在慢性牙周炎发展过程中的变化及其对牙周组织的影响，对于判断慢性牙周炎的发生发展，辅助临床诊断、治疗具有重要意义。

1.TNF-α

TNF-α 大多由单核细胞和巨噬细胞响应口腔细菌成分(如LPS)而产生，由233 个氨基酸长的II型跨膜蛋白构成，稳定排列于同源三聚体中[3]。从这种膜整合形式中，可溶性同源三聚体细胞因子(sTNF)通过金属蛋白酶TNF-α 转化酶(tumor necrosisfactor-α conveting enzyme，TACE，也称为adisintegrin and metalloproteinase 17,ADAM17)的蛋白水解切割释放[4]。除此之外，在牙周组织中，成纤维细胞也是它的来源细胞。TNF-α 是一种有效参与全身炎症的细胞信号蛋白，具有广泛的生物学效应，是构成急性期反应的细胞因子之一。

在慢性牙周炎中，牙菌斑及其毒性产物引发并驱动了初期炎症反应，同时激活了宿主的防御细胞，产生并释放了多种细胞因子，TNF-α 作为其中一种主要的内源因子即炎症介质，在免疫反应中起到重要的调节作用。在慢性牙周炎的发生发展过程中，起初，TNF-α 作为启动抗菌炎症反应的关键细胞因子，可引起白细胞在炎症部位的聚集，激活炎性白细胞去杀灭细菌微生物，起到抗细菌感染的作用；但是随着炎性刺激的不断产生，TNF-α大量分泌，它通过刺激促炎因子如IL-1、IL-6 的产生及抑制抗炎因子如IL-10(interleukin-10，IL-10)[5]的分泌，引起细胞粘附分子和趋化因子的表达等来进一步加重炎症反应，并且在介导炎症反应的同时，还能够上调胶原酶、PGE2的分泌，促进骨吸收相关因子的产生[3]，在牙周组织的改建过程中发挥着重要作用。

2.与慢性牙周炎相关的TNF-α 水平变化

在慢性牙周炎患者发生炎症的牙龈组织中以及龈沟液中能够检测到大量的TNF-α，其水平相较于正常组织明显升高。

牙龈组织由上皮和结缔组织构成，属于口腔咀嚼黏膜。当牙龈与牙齿的结合部位出现大量的菌斑等刺激物时，其中某些抗原性物质可通过龈沟内上皮和结合上皮渗入到牙龈结缔组织中，引发宿主的免疫反应和炎症反应。慢性牙周炎发生时，Duarte等[6]通过检测发现，牙龈组织中的TNF-α 水平显著增高，这个结果与Górska 等[7]的研究结果相一致，他们的实验评价了慢性牙周炎患者牙龈组织和血清中细胞因子的蛋白水平，并且观察到牙周部位的细胞因子水平普遍较高；另外，在成人有炎症病变牙龈中，TNF-α 的mRNA 的表达强度也明显高于正常龈组织[8]。

龈沟液(gingival crevicular fluid,GCF)是指牙龈结缔组织因渗透梯度产生并渗出到龈沟内的液体。在诸如慢性牙周炎等炎性感染条件下，GCF 会大量渗出并且其中包含炎性细胞、细菌、组织分解产物、抗体、补体系统蛋白和酶以及包括TNF-α在内的多种炎性分子[9]。大量实验证实，慢性牙周炎患者病变牙龈周围的GCF 中，TNF-α 浓度明显增加，这与病变牙龈组织中TNF-α 蛋白水平增加的结论是一致的，即在牙周炎症反应过程中，牙周组织中受抗原刺激的细胞分泌TNF-α 等炎性细胞因子参与炎症反应，并分布于组织中或随着组织渗出物分布于炎症组织周围参与宿主的免疫反应。

但是在关于慢性牙周炎患者外周血中TNF-α含量变化的研究上，目前尚存在争议。一般而言，血清与牙龈组织和GCF 相比，含有的细胞因子水平较低。有研究者表示，在以往的研究中没有发现血清和牙周组织中TNF-α 蛋白水平之间的相关性，Górska 等[7]的研究也表示牙周炎患者中炎性细胞因子(包括TNF-α)并非系统性增加，但Iacopino等[10]却在研究时发现牙周炎症发生时，TNF-α 含量的增加不仅表现在局部的牙周组织和龈沟液中，还可能表现在患者的外周血中，且随着疾病的炎症程度的增加而增加。实验表明，在排除吸烟对血清中TNF-α 含量造成影响的前提下，慢性牙周炎患者血清中TNF-α 的浓度水平明显高于正常组，且经过牙周基础治疗或手术治疗后，在患者牙周临床症状有所减轻时，测得血清中的TNF-α 浓度相较于之前有明显降低[11]。而血清中TNF-α 的含量与心血管疾病的发生密切相关，大量的研究显示慢性牙周炎能诱发和加重心血管疾病[12]，但二者之间关联的模式及密切程度尚不完全清楚。这也间接成为了支持牙周炎患者外周血中TNF-α 系统性增加的证据。

3.TNF-α 对牙周组织的主要影响

TNF-α 产生于机体对细菌及细菌产物的反应过程中[13]，对先天性和适应性免疫系统中的一系列细胞具有免疫调节作用，而且作为重要的炎症因子，能够促进炎症反应的发生，导致牙周组织的破坏，并同时抑制其修复，如表1 所示。细胞去杀灭细菌微生物，充分发挥其免疫调节作用以抵御侵袭。当宿主防御功能足够强大并得到了适当的治疗时，牙周组织病变停止或修复，慢性牙周炎在发病初期即能得到良好的控制。

3.2 软组织破坏 最初确诊慢性牙周炎的最重要的临床特征即为牙周袋的产生，这也是慢性牙周炎最重要的病理改变之一。牙周袋的产生意味着牙龈结缔组织中胶原纤维和基质的溶解破坏。

在活动性牙周炎期间，牙龈连接组织(主要是胶原蛋白)的降解主要是由于炎性细胞和驻留细胞如成纤维细胞和上皮细胞或内皮细胞原位表达MMPs 增加所致。MMPs 是一个金属依赖性细胞外蛋白酶的大家族，负责细胞外基质的组织重塑和降解，包括胶原蛋白、弹性蛋白、明胶、基质糖蛋白和蛋白多糖。在慢性牙周炎患者的龈沟液、牙龈组织中可检测到MMPs 水平有显著升高[14]。Wang[15]、Ohta[16]、Ozgören[17]等人的实验研究均能够证明TNF-α 可以诱导MMPs 的产生，即炎症发生时，炎性细胞因子TNF-α 能够上调MMPs的表达，加速组织破坏。

TNF-α 还可诱导VEGF 的产生。在慢性牙周炎患者组中所提取的龈沟液中，TNF-α 和VEGF的含量都是显著高于单纯龈炎组及健康人群组[18]。VEGF 是发炎组织(包括牙龈)内血管系统增殖的重要因子[19]。VEGF 在Th1 介导的炎症期间被诱导

表1 TNF-α 在慢性牙周炎中的主要功能

3.1 免疫调节 当菌斑微生物及其代谢产物对牙周组织产生刺激时，可引发机体的免疫反应。在反应初期，局部较低浓度的TNF-α 能够协同刺激抗原提呈细胞和T 细胞的活化，促进B 细胞增殖和分泌抗体，参与招募白细胞到炎症组织并激活白并且增加血管大小、数量和表面积，它可以通过增强抗原致敏作用将炎症部位的先天免疫和适应性免疫联系起来，导致Th2 型细胞因子的产生和慢性炎症的形成，因此它可能是牙龈炎症严重程度的关键因素。Oyama 等[20]证实了TNF-α 可诱导人类牙周韧带细胞中的VEGF 表达，尤其是患有牙周炎的牙龈组织，通常伴有肿胀、水肿、渗出和重度新生血管形成，TNF-α 作为一种有效的VEGF 诱导剂，通过VEGF 促进异常血管的产生和其增加血管通透性的能力，进而助于炎症的增加和扩展，这可能会加重牙周病损伤。

3.3 骨吸收 牙槽骨吸收是慢性牙周炎特征性的临床症状之一。慢性牙周炎发生时，牙周组织中的巨噬细胞、成纤维细胞等受抗原刺激产生大量TNF-α，激活破骨细胞，导致牙槽骨出现吸收，长期的牙周抗原刺激使牙槽骨出现持续性吸收，最终难以为患牙提供足够的支持力，导致牙齿松动、脱落。

据报道TNF-α 可在体外诱导骨髓巨噬细胞形成破骨细胞[21]。破骨细胞是由单核细胞/巨噬细胞谱系的前体细胞融合形成的多核巨细胞，是体内骨吸收的唯一原因，其分化受核因子κB 受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL)和核因子κB 受体活化因子(receptor activator for nuclear factor-κB,RANK)调 节，TNF-α 通过激活PI3K/Akt 信号传导协同促进RANKL 诱导的破骨细胞形成[22]，另有数据表明[23]，当RANKL 水平没有升高时，TNF-α 也可直接作用于破骨细胞前体以加强RANKL 诱导的破骨细胞生成。

PG 是一种在环氧化酶(cyclooxygenase，COX)作用下产生的花生四烯酸的代谢产物，同样与慢性牙周炎中的骨丧失密切相关，TNF-α 可诱导COX稳态蛋白的产生，进而增加PGE2的分泌[24]。因此，TNF-α 与PGE2的生物合成有十分重要的联系。在牙周组织中，PGE2主要是由巨噬细胞和成纤维细胞产生，它可通过刺激骨母细胞、基质细胞或直接刺激破骨细胞祖细胞(前体破骨细胞)来影响炎症诱导的破骨细胞生成[25]，刺激炎症因子增加，进而加速慢性牙周炎的骨吸收。

另外，TNF-α 可产生SAA，SAA 是各种全身性疾病中研究最多的生物标志物之一，主要响应于炎症或感染的释放。Ardila 和Guzmán[26]的报告显示，慢性牙周炎患者中的SAA 水平明显高于未患有牙周炎的人群。慢性牙周炎与类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是具有相似病理特征的慢性炎性病症[27]，SAA 可在RA 的促炎过程中发挥重要的致病作用，致使患者出现软骨及骨组织的破坏，其在慢性牙周炎的骨吸收过程中同样发挥作用。近年来，在对克罗恩病的研究中，TNF-α 的高表达，也直接证明了TNF-α 与破骨细胞的关系及对骨吸收的影响[28]。

3.4 抑制牙周组织修复 在患有慢性牙周炎的个体中，牙周组织的修复与破坏是同时存在的，当牙周炎处于活动进展期时，即使是很严重的病变，牙周也同样存在愈合的迹象，但是愈合重建的过程会受到各种炎症因子不同程度的抑制，导致牙周组织整体表现为破坏大于愈合，疾病呈现进展的状态。

TNF-α 除了本身可以介导炎症反应，诱导破骨细胞参与骨吸收之外，还可以通过降低牙周膜纤维细胞碱性磷酸酶的活性来抑制牙周膜细胞向成骨细胞的功能转化，抑制骨形成。另外，TNF-α 可通过促进runt 相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,RUNX2)mRNA 的降解，作用于成骨细胞以抑制RUNX2 的转录，而RUNX2 是成骨细胞分化的主要转录因子。TNF-α 还可抑制丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)介导的osterix(与成骨细胞分化和骨形成有关的转录因子)表达和启动子活性，增加Fas(与细胞凋亡有关的膜表面分子)表达，并诱导细胞凋亡[21]。

牙周炎中TNF-α 的高表达会对人牙周膜细胞和牙龈细胞的增殖活性及细胞周期蛋白的表达产生不定程度的抑制。胶原纤维是构成牙周结缔组织的主要成分，它能够经由成纤维细胞分泌的胶原蛋白分子相互结合形成，而TNF-α 通过调节成纤维细胞的合成代谢，抑制胶原和纤维连接蛋白的产生，使得炎症状态下的牙周组织的整个修复过程受到阻碍，进而使得牙周炎症状不断加重。

4.TNF-α 的临床意义

临床研究显示，慢性牙周炎组患者龈沟液内的TNF-α 水平明显高于单纯龈炎组及健康对照组，且经过手术或非手术手段治疗后，慢性牙周炎的临床症状及指征明显好转，同时TNF-α 的水平也有明显下降[29]。尽管在GCF 中TNF-α 水平与不同类型的牙周炎之间没有相关性[30]，但其分子水平与牙周破坏的严重程度却密切相关，因此可用于比较不同阶段的牙周炎。但是当TNF-α 用于监测治疗后的牙周愈合时，临床记录的改善却是相互矛盾的，这些差异可能与TNF-α 从牙周组织到GCF的动力学和/或流通相关，但此前的研究并未能明确牙周韧带对GCF 的组成有何种实际影响。并且通过Newcastle-Ottawa 量表对病例对照研究和应用Jaddad 量表对临床试验风险偏差进行评估，结果也显示纳入的25 项研究(12 项病例对照，6 项临床试验和7 项随机对照试验)中，大多数病例对照研究显示牙周病患者的GCF 中TNF-α 浓度增加；已经证明TNF-α 水平与慢性退行性变化的表现之间没有相关性，如牙龈指数，斑块指数或探查深度，而临床试验和随机对照试验表明，牙周干预后TNF-α 水平没有一致的改变，即在常规治疗后，未能证实TNF-α 的持续减少[31]。因此可以得到的结论是：目前的数据支持使用GCF 中的TNF-α作为诊断牙周病的潜在生物标志物，但不可用其监测治疗后的愈合状态。

由于目前对TNF-α 在慢性牙周炎中的作用进行了一定了解，临床上可以利用TNF-α 抑制剂调节TNF-α 水平作相关辅助治疗，但在TNF-α 抑制剂的应用管理上包括用药剂量、方法都需要做进一步的探索及研究。

5.TNF-α 基因研究及展望

慢性牙周炎是一种多因素疾病，在基因水平上，不同个体产生细胞因子的基因能够表现出多态性，这可以改变促炎细胞因子的合成使蛋白质表达产生变化，进而使牙周炎呈现不同的临床表现，这决定了不同人群对牙周炎的易感性。TNF-α 基因位于人的第6 号染色体的短臂上，主要编码由巨噬细胞分泌的多功能促炎细胞因子。有相关学者对启动子区TNF-α 基因多态性进行了研究，结果显示，其中一些基因多态性与牙周炎的严重程度有关；此外，还有大量学者旨在研究不同种族和不同人群中TNF-α 基因多态性的相关性[32,33]。然而不同TNF-α 基因型对表型细胞因子产生的影响至今尚不完全清楚。TNF-α 基因启动子多态性对牙周病严重程度和临床结果可能产生的影响仍有待阐明。已有相关学者对不同人群中TNF-α 启动子多态性与牙周炎之间的关系进行了研究[34]，虽然结果显示TNF-α 相关基因多态性增加了人群患慢性牙周炎的风险，但这仍然是一个存在争论性的话题。

对于TNF-α 的研究不仅有助于更加深刻了解慢性牙周炎，辅助其诊断和治疗，对其他与慢性牙周炎具有相似发病机制及病理改变的疾病，如种植体周围疾病(分为种植体周围黏膜炎和种植体周围炎)的研究也有重要的指导意义，目前还没有足够的研究来证明TNF-α 在种植体周围疾病进展中的作用[35]，本文也可为其临床的进一步研究提供一定的理论基础，但具体机制仍有待深入探究。