ARMS法和Sanger测序法检测晚期肺腺癌小标本EGFR基因突变的对比分析

李爱锋

摘 要：目的：分析ARMS法（amplification refractory mutation system）和Sanger測序法检测晚期肺腺癌小标本EGFR基因突变的效果。方法：选择浓度相同的人类EBFR基因18、19、20、21号外显子野生型质粒、突变型质粒按照一定比例混合制备成20种标准模板，将其均分为对照组和观察组，各20例，采用ARMS法检测小样本中的EGFR基因突变情况，采用Sanger测序法对EGFR基因18、19、20、21号外显子野生型及突变型标准质粒多种混合比例样本进行检测，比较两种检测方法的一致性。结果：对照组与观察组基因突变率均为100%，两种检测方法的一致率为100%。结论：临床上采用ARMS法和Sanger测序法检测晚期肺腺癌小标本EGFR基因突变，两种检测方法的检测结果具有较高的一致性。

关键词：ARMS法;Sanger测序法;晚期肺腺癌;小标本EGFR;基因突变

前言

肺癌的发病率在逐年上升，但是有研究人员发现，临床上有75% 左右的肺癌患者在被确诊时就已是局部晚期，部分患者已经出现了远处转移，比较常见的一种亚型就是腺癌。在接受全身化疗的晚期肺癌中，有大部分患者只需要通过小活检标本或者细胞学样本就能被明确诊断[1]。EGFR基因检测是临床上诊断肺癌分子的重要手段，目前应用比较广泛的有ARMS法和Sanger测序法，从理论上发现，ARMS法较Sanger测序法的特异度和灵敏度均比较高，但是其在小样本检测中存在差异的报道比较少。而目前，对于临床晚期肺癌患者来说，其病理标本大多为小组织样本，因此，对两种方法检测晚期肺癌小样本EGFR基因突变的价值进行比较是非常有必要的。本次就对两种方法检测晚期肺腺癌患者小样本EGFR基因突变的效果进行详细的分析。

1资料与方法

1.1研究对象

选择浓度相同的人类EBFR基因18、19、20、21号外显子野生型质粒、突变型质粒按照一定比例混合制备成20种标准模板，分为对照组和观察组，具体如下：

1.2方法

1.2.1采用ARMS法检测对照组小样本中的EGFR基因突变情况。使用人类EGFR基因突变检测试剂盒（蝎形探针ARMS荧光PCR法）therascreen      EGFR RGQ PCR Kit以及Lightcycler 480进行基因检测。

结果分析实验步骤：

（1）参照ABI7500操作手册进行软件操作。

依据检测结果判断，报告检测标本有无基因突变。

a.在PCR管冰架上架上灭菌后的八联管，将反应混合物依次加入八联管中，然后小心的盖上八联管管盖;

b.将加样后封闭好的八联管振荡混匀，然后离心使液体聚于管底;

c.按下PCR仪上的出舱键，将八联管放于舱中，然后点击进舱送入荧光定量PCR仪中;

d.仪器显示正常，然后编辑反应程序，选择Taqman反应程序：

（2）在FAM通道，运行外控（Control）Ct值（Cycle threshold，循环阈值）的计算，Ct值≤34.0，可以继续分析。

（3）运行无模板对照（NTC）时，FAM信号无曲线升起，说明实验无污染存在，可以继续分析实验情况。当Ct值≥35.0时，有微弱的扩增信号，对实验的影响极微，可以继续分析实验情况。

（4）运行阳性质控品，所有阳性质控Ct值一般小于30.0。

（5）在FAM通道中运行Ct的计算，结果如下：

检测样品均曲线呈S型且C≤34.0;阴性对照（NTC）无扩增曲线或Ct值≥35.0;阳性对照出现扩增曲线且Ct值≤30.0。

依据检测结果判断，报告检测样品均有基因突变。

1.2.2采用Sanger测序法检测观察组小样本中的EGFR基因突变情况。使用4组引物对EGFR外显子18-21进行PCR扩增，使用循环测序试剂盒及ABI3730进行正向和反向测序。

对表1 中20种模板采用与EGFR癌基因样本同样的引物、反应体系及循环条件进行扩增测序，样本采用的是2轮PCR扩增，2轮的扩增引物相同，具体见表2-表4。

表3  第一轮的PCR程序如下：

表4  第二轮的PCR程序如下：

PCR产物电泳产生明显条带，才对产物割胶纯化后测序，验证Sanger测序法对突变检测的灵敏度，对突变型与野生型混合质粒系列用Sanger法测序，验证其对突变的检测极限，引物是F端和R端引物。进行重复的平行测序。

Sanger测序法对人类EBFR基因18、19、20、21号外显子野生型质粒、突变型质粒按照不同比例混合样本检测结果显示，扩增产物经割胶纯化后进行测序反应，均可检测出10%比例突变，具体如下：

- EGFR 18号外显子在10%混合比例时可以检测出杂合;

- EGFR 19号外显子在10%混合比例时可以检测出杂合;

- EGFR 20号外显子在10%混合比例时可以检测出杂合;

- EGFR 21号外显子在10%混合比例时可以检测出杂合。

1.3观察指标

比较两种检测方法的一致性。

1.4统计学分析

采用SPSS19.0统计软件进行数据分析，以P<0.05，表示差异有统计学意义为标准，将其中的计量资料用均数标准差表示，用t检验，将其中的计数资料用%表示，用χ2检验。

2结果

2.1对照组EGFR基因检测结果

对照组EGFR基因突变率为100%（20/20），野生型0%（0/20），其中外显子18突变5例，外显子19突变5例，外显子20突变5例，外显子21突变5例。

2.2观察组EGFR基因检测结果。

观察組EGFR基因突变率为100%（20/20），野生型0%（0/20），其中外显子18突变5例，外显子19突变5例，外显子20突变5例，外显子21突变5例。

2.3ARMS法和Sanger测序法检测晚期肺腺癌小标本EGFR基因突变的一致性

对20列小标本EGFR基因突变情况均采用了ARMS法和Sanger测序法检测，两种检测方法的一致率为100%（20/20），Kappa系数为1，P<0.05。

3讨论

NCCN指南中推荐的根据是否存在EGFR基因突变实践对晚期肺腺癌患者的治疗进行了指导，并且不同的EGFR基因突变类型，其采用靶向治疗后的效果也存在着明显的差异，因此，对肺腺癌患者的EGFR基因突变情况进行准确的检测，能够为临床治疗提供有效的指导依据[2]。但是临床上EGFR基因突变的检测结果与临床因素、检测方法、小样本因素等有关[3]。

ARMS法和Sanger测序法是临床上常用的小标本EGFR基因突变检测方法，前者能够检测出组织中0.1%～1%的突变体，而后者对EGFR基因突变细胞的检出率为10%～20%[4]。当样本中的DNA难以达到分光光度法所能够检测到最低限度时，小剂量与低比例的肿瘤DNA则会被误诊为EGFR野生型。样本的选择对检测结果也有着重要的影响，临床上所使用的标本大都是经过福尔马林固定且被包埋于石蜡中，这对标本中核酸的完整性造成了破坏。近年来，随着技术手段的进步，用于EGFR基因突变情况检测的样本也逐渐多样化，如手术切除、活检、胸水、外周血等[5]。

本次研究中分别使用了ARMS法和Sanger测序法对20列小标本EGFR基因突变检测，结果发现，对照组与观察组突变率均为100%（20/20），两种检测方法的一致率为100%（20/20）。提示，对于肿瘤细胞比较少的样本，就需要使用敏感性比较高的方法进行检测[6、7]。

综上所述，临床上采用ARMS法和Sanger测序法检测晚期肺腺癌小标本EGFR基因突变情况，两种检测方法具有较高的一致性。但是，对肺腺癌小标本组织行ARMS法和Sanger测序法检测小标本EGFR基因突变还存在在这一定的差异性，尤其是采用Sanger测序法检测晚期肺腺癌小标本EGFR基因突变情况时应谨慎决定，因为其最低检测限在10%左右。

参考文献：

[1]梁红玲，李洪胜，黄健清，等.Sanger测序法和Snapshot法检测乳腺癌BIM缺失多态性比较分析[J].循证医学，2018，18（06）：370-375.

[2]葛闯，易琳，唐万燕，等.Sanger测序与ARMS-PCR在非小细胞肺癌EGFR基因突变检测中的比较及应用评价[J].国际检验医学杂志，2018，39（21）：2648-2653.

[3]梁继珍，苏宁，谢亚琳，等.ARMS法和Sanger测序法检测晚期肺腺癌小标本EGFR基因突变分析[J].实用医学杂志，2018，34（13）：2104-2107+2118.

[4]唐翠兰，郑晓克，周建文，等.ARMS法与下一代测序法检测非小细胞肺癌EGFR基因突变的比较[J].解剖学研究，2018，40（01）：49-53.

[5]肖越.ARMS法在检测晚期肺腺癌不同小标本中EGFR基因突变的比较[D].南昌大学，2014，22（16）：256-268.

[6]苏宁.ARMS法和测序法检测晚期肺腺癌小标本EGFR基因突变的分析[A].中国抗癌协会，2013，34（07）：1247-1251.

[7]梁继珍，苏宁，谢亚琳，et al.ARMS法和Sanger测序法检测晚期肺腺癌小标本EGFR基因突变分析[J].实用医学杂志，2018（1）：2104-2107，2118.