分子生物学技术在微生物群落研究中的应用

刘华健

摘 要：微生物群落有个体小，种类多，不易观察等特点，分子生物技术的兴起弥补了传统方法对于微生物群落研究的不足，简单介绍了DGGE技术、T？RFLP技术、高通量测序等目前应用较为广泛的分子生物学技术，包括技术原理，研究过程，和优缺点等。

关键词：微生物群落;DGGE技术;T-RFLP技术;高通量测序技术

微生物数量大种类多，在生物地球化学循环中起着至关重要的作用，传统的培养法等很难对微生物群落的作出全面深入的研究，自PCR法发明后，基于分子生物学技术方法应运而生，在微生物群落的研究中正广泛的应用起来。

一、DGGE技术

DGGE（Denatured Gradient Gel Electrophoresis）技术，即变性梯度凝胶电泳技术，它最早是由Fischer和Lerman于1979年提出的，最初用于检测DNA的点突变。1993年Muyzcr等人首次将DEEG技术运用于微生物群落结构的研究中，并且发现此项技术对于微生物群落的种群差异和遗传多样性方面的研究具有很大的优势[1]。此电泳技术分离DNA的原理主要利用相同长度的DNA片段由于其碱基组成不同，解链时需要的变性剂浓度不同，导致DNA链在由低到高浓度的聚丙烯酰胺凝胶中移动时，会在不同的浓度下变性而减慢移动速度，从而把DNA链分离开来。此项技术已经成为微生物群落分子生态学的主要研究方法之一。

实验流程为，微生物DNA的提取：可用CTAB法或生物公司的DNA提取试剂盒在无菌工作台上提取微生物DNA。目的基因扩增：根据其所研究微生物的种类不同选取具有高度保守区的基因序列进行扩增，如原核微生物一般选取16S rDNA的V3、V4、V5等区域，真核微生物一般对其ITS和18S rDNA基因片段等进行扩增。电泳及电泳图谱分析：电泳与琼脂糖电泳相似，制胶时需要注意根据所扩增的目的基因制备合适浓度的变性凝胶。跑完的凝胶经过染色后形成可视条带，可通过Quantity One等软件来分析电泳条带，来对微生物群落进行聚类和相似性等分析。DGGE技术，具有分辨率高、操作简单迅速、重复性好等优点，但也有对环境微生物含量要求高、有些物种基因的不同拷贝中之间存在异质性问题等缺点[2]。

二、T-RFLP技术

T-RFLP（Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism，末端标记限制性片段长度多态性）技术，是对人类遗传学家1980年提出的PCR-RFLP技术的改良，使其更快速有效具有更高的分辨率，更容易操作分析，在微生物群落分析中有明显的技术优势[3]。T-RFLP技术主要技术原理是因不同物种基因序列存在差异，导致用限制性酶切后的基因片段长度不同，荧光标记的不同长度的限制性片段代表不同的细菌种类，从而达到对微生物群落结构多样性等进行分析的目的。

T-RFLP的主要流程，先提取微生物群落的总DNA，用末端标记的引物PCR扩增细菌的16S rDNA（以细菌为例，真菌可扩增26S rDNA等），然后选择合适的限制性核酸内切酶对扩增后的末端带有荧光16S rDNA进行酶切。酶切后的产物用DNA自动测序仪进行片段分离，末端带有荧光标记的片段被分离出来，因为每一种菌末端带有荧光标记片段长度不同，所以测序仪上的峰值图上，每一个峰值代表着一个细菌。峰值曲线下的面积越大代表该菌种的数量越多。

T-RFLP技术有快速、高分辨率、重复性高等优点，但其存在只能提供微生物的种类和相对数量的信息的缺点[4]，所以现在对利用T-RFLP技术的应用相对减少，但对于一些不需要严格定性分析的微生物群落调查中，T-RFLP技术仍然具有很大的技术优势。如2016年龙海等人，利用T-RFLP技术对深港两地的工程土壤细菌多样性进行了多样性分析。发现香港段土壤大约有141属，235种细菌，深圳段大约存在132属，206种。其中香港段的特有种属有32个，深圳段的特有种有3个[5]。

三、高通量测序技术

高通量测序技术也叫第二代测序技术，2005年Roche公司首先推出了焦磷酸测序技术，实现了超高通量的基因测序，开创了第二代测序的先河[6]。随后Illmina公司和ABI公司也相继推出了自己的Solexa和SOLiD技术，目前Roche公司的焦磷酸测序技术面临淘汰，Illmina公司的Hiseq测序技术应用广泛，是目前全球使用量最大的第二代测序机器。

Illmina公司的Hiseq测序技术采用边合成边测序的原理，DNA在复制时加入带有荧光标记的ddNTP无3′羟基，在合成中不能形成磷酸二酯键而终止合成反应，根据4种荧光标记的ddNTP（分为：ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP）显示的荧光颜色不同和碱基互补配对原则，就能知晓所测片段的DNA序列。

高通量实验流程易操作，关于微生物总DNA的提取，和目的片段（16S rDNA、ITS等）PCR的扩增，与前面所介绍的分子生物学技术步骤基本相同。PCR扩增尽量选取低循环数扩增以免造成误差。PCR扩增后的待测序列用超声波打断成200-500的小片段DNA，在其3′端加A碱基，构建DNA文库，然后把构建好的DNA文库放入测序机器的测序流动槽中，利用桥式PCR扩增上样DNA链，最后边合成边测序，利用相机拍摄的荧光颜色通过电脑程序得出所测序的DNA序列。测序的序列还要经过拼接优化，并与基因库里的基因做比对，确认所对应的物种信息后才能做后续微生物群落分析。高通量测序技术具有效率高、准确性高、可定量、测序通量大等特点。但也存在实验耗资贵，数据量庞大带来的后续分析困难等问题[7]。

微生物群落的研究中，在要求不高的情况下传统的分析技术还有其很大的实用性，但对于微生物群落大量更深层次的研究中分子生物学技术的产生具有划时代的意义，目前多种技术的应用和伴随科技的发展更多的实用技术的产生（如，第三代测序技术）会使研究者对微生物群落的调查研究更深入更方便快捷。

参考文献：

[1]张明月.DGGE用于两种不同类型生境的微生物群落结构的研究[D].上海：上海海洋大学，2012

[2]刘莹.夏季北冰洋海域微微型和微型浮游生物的多样性及其群落结构研究[D].上海：上海海洋大学，2013

[3]王孟孟，杨兆光， 李海普等.陆地环境微生物多样性研究技术的进展[J]. 化学工程与装备，2018，（8）：277—278.

[4]贾俊涛，宋林生， 李筠等.T？RFLP技术及其在微生物群落结构研究中的应用[J]. 海洋科學，2004，28（3）：64—68.

[5]龙海，章桂明，冯建军等.深港两地工程土壤细菌多样性的T？RFLP分析[J]. 生物技术通讯，2016，27（1）：106—109.

[6]王兴春，杨致荣，王敏等.高通量测序技术及其应用[J]. 中国生物工程杂志，2012，32（1）：109—114.

[7]王绍祥，杨洲祥，孙真等.高通量测序技术在水环境微生物群落多样性中的应用[J]. 化学通报，2014，77（3）：196—203.