混菌固态发酵菜籽粕生产饲用复合酶发酵条件研究

温拥军　游玟娟

摘 要：为了提高混菌发酵菜籽粕产饲用复合酶的产量，对混菌组合和配比进行研究，采用响应面法对其发酵条件进行了研究。结果表明：最佳菌种组合及配比为枯草芽孢杆菌、毛霉、酵母菌（1：1：1）;在单因素实验基础上，以饲用复合酶活力为指标，进行Box-Behnken设计，获得最佳发酵条件为：发酵温度35.6℃，时间68h，接种量为9.62%，该条件下饲用复合酶的产量达到5764 U/g，比未优化前提高了3.4%。

关键词：菜籽粕;固态发酵;混菌;饲用复合酶;发酵条件;优化

Abatract：In order to improve the yield of feed compound enzyme from rapeseed meal fermented by mixed bacteria， the combination and proportion of mixed bacteria were studied， and the fermentation conditions were studied by response surface method. The results showed that the best combination and proportion of strains were Bacillus subtilis， Mucor and S.cerevisiae （1：1：1）;The optimal fermentation technology was obtained as following：fermentation temperature 35.6℃， time 68h， inoculation amount 9.62%. Under this condition， the yield of fitted model was 5764U/ g， which increased 3.4% compared with the original conditions.

Key words：rapeseed meal;solid-state fermentation;mixed bacteria;feed compound enzyme;fermentation condition;optimization

菜籽粕是油菜籽經预压浸出工艺处理后得到的副产物，富含有蛋白质、粗纤维等营养组分，Ca2+、Mg2+等矿物质，以及维生素B、胆碱等维生素，菜籽粕经脱毒处理后是制作牲畜与家禽饲料的主要原料，还可以用于制作食品、化妆品和抗菌素原料[1-3]。饲用复合酶是一种饲料添加剂，主要由水解酶组成，包括淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、植酸酶、纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶等[4-5]。添加复合酶能补充动物体内源酶的不足，消除饲料中的抗营养因子，释放营养物质，显著提高饲料的利用率，改善动物的生产性能等[6-7]。

目前国内外对菜籽粕研究报道较多，主要集中在脱毒、灭菌条件、以及作为饲料组分等方面[8-9]，对菜籽粕的综合利用报道较少。本实验利用混菌固态发酵菜籽粕生产饲用复合酶，并采用响应曲面法优化发酵条件，旨在提高酶产量，进一步降低生产成本，利用菜籽粕发酵生产饲用复合酶，对扩大菜籽粕的应用范围，促进其综合利用有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），毛霉（Mucor），黑曲霉（Aspergillus niger），酵母菌（S.cerevisiae），购于中国微生物菌种保藏中心，由本院生物制药国家重点实训基地保藏。

斜面培养基：PDA培养基：马铃薯（去皮）20%，葡萄糖：2%，琼脂：2%;牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏;0.3%，蛋白胨：1%，NaCl：0.5%，琼脂：2%。

发酵培养基：脱毒菜饼50g，0.1%CaCl2，1.5%NH4Cl，2%K2HPO4，0.2%MgSO4，0.5%MnSO4，1%Tween-80，混匀备用。

CBV-1500A超净工作台（上海瑞仰净化装备有限公司）;QYC.2102恒温培养摇床（上海福玛实验设备有限公司）;HPS-250生化培养箱（哈尔滨东明医疗仪器厂）;LDZ4-0.8A离心机（北京医用离心机厂）;UV-9100紫外可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）;HH.SYH-Ni2-C水浴锅（北京长源实验设备厂）。

1.2 实验方法

1.2.1 菜籽粕的预处理

利用乙醇法脱毒[10]，脱除有毒物质硫甙等物质，达到脱毒目的。

1.2.2 混菌的选择

装50g菜籽粕发酵培养基于250mL摇瓶中，分别按不同组合和比例接入枯草芽孢杆菌、毛霉、酵母菌、黑曲霉4种菌种，于温度为36℃、转速为200转/分的摇床上发酵培养3d，测定蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶三种酶的总酶活，以选择出混菌发酵的菌种组合。

1.2.3 粗酶液制备

取发酵产物10g，溶于50mL水中，置于4000r/min的离心机上离心分离15min，取上清液经8层纱布过滤所得澄清液体即为粗酶液。

1.2.4 蛋白酶活力测定

按GB/T23527-2009进行[11]。酶活力单位定义：在pH7.0、40℃条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量为1个蛋白酶活力单位（U）。

1.2.5 淀粉酶活力测定

采用DNS法[12]进行测定。淀粉酶活力单位定义：在pH5.5、50℃条件下，1min分解淀粉释放出1μg还原糖所需的酶量为1个蛋白酶活力单位（U）。

1.2.6 纤维素酶活力测定

采用DNS法[13]进行测定。纤维素酶活力单位定义：在50℃条件下，在1min内酶解生成1μg还原糖的酶量为1U。

1.2.7 饲用复合酶总活力

其计算公式如下：

饲用复合酶总活力=蛋白酶活力+淀粉酶活力+纤维素酶活力

1.2.8 单因素实验设计

分别以发酵温度、发酵时间、转速、接种量为单因素进行实验，探讨各因素对饲用复合酶总酶活的影响。发酵温度分别为32、34、36、38、40℃，发酵时间分别为24、36、48、60、72h，转速分别为160、180、200、220、240r/min，接种量2%、4%、6%、8%、10%。

1.2.9 响应面分析

在单因素实验基础上，按Box-Behnken实验设计原理，选取温度、转速、接种量进行三因素三水平中心组合实验，见表1。利用mintab15软件进行分析，确定最佳发酵条件。

2 结果与分析

2.1 不同混菌组合发酵结果

按实验方法，将供试菌种按1：1比例两两组合，或三者组合混菌发酵72h，测定饲用复合酶總酶活，得到结果如表2所示。

从表2结果可知，在混菌组合中，相对于其他组合来讲B+M+S的饲用复合酶总酶活最高，达到5594U/g，表现出良好的协同性。因此最佳组合为枯草芽孢杆菌、毛霉、酵母菌（1：1：1）。

2.2 单因素实验结果与分析

2.2.1 发酵温度对饲用复合酶活力的影响

一般来讲，微生物发酵均存在最适发酵温度。从图1结果来看，发酵温度对饲用复合酶活力存在显著影响，最适发酵温度为36℃，该温度下饲用复合酶总酶活为5590U/g。

2.2.2 发酵时间对饲用复合酶活力的影响

由图2可知，在考察的24h～72h发酵时间内，饲用复合酶活力随时间的增加而增大，但超过72h后，增速减缓，因此从效益角度来看，发酵时间选72h为佳。

2.2.3 转速对饲用复合酶活力的影响

摇床转速主要是影响发酵中溶解氧，由图3可以看出，转速对饲用复合酶活力影响不显著。当转速200r/min时，饲用复合酶活力最高，为5705U/g，故转速宜选200r/min。

2.2.4 接种量对饲用复合酶活力的影响

从图4可知，接种量与中性蛋白酶活力呈正相关。接种量为8%，饲用复合酶活力为5713U/g。但当接种量>8%后，酶活的增速减缓。适当增加接种量，能节约生产时间，但接种量太大则会增加制备种子液的成本，因此接种量宜选8%。

2.3 响应面实验结果与分析

选取对影响中性蛋白酶活力较显著温度（X1）、时间（X2）、接种量（X3）3个因素作为考察对象，其他因素设定为最佳水平。采用Minitab15软件按Box-Behnken方法进行3因素3个水平实验设计。BBD实验结果见表3。

利用Minitab15软件对表4数据进行二次多元回归拟合，得到二次多项回归模型，解得到最佳条件为：X1=-0.18、X2=-0.33、X3=1.62，换算成实际水平，即：发酵温度35.6℃，时间68h，接种量为9.62%，该条件下饲用复合酶的产量达到5764 U/g，比原始条件提高了3.4%。

3 结论

本实验采用响应曲面法研究了混菌发酵菜籽粕产饲用复合酶的条件。确定了混菌发酵菌种为枯草芽孢杆菌、毛霉、酵母菌（1：1：1）;通过单因素实验确定了各显著因素及水平，分别为：温度36℃，时间72h，接种量8.%。在此基础上运用Box-Behnken设计，采用Minitab15软件对实验结果进行多元回归拟合得到二次多项回归模式，通过求偏导数，得到最佳条件为：发酵温度35.6℃，时间68h，接种量为9.62%，该条件下饲用复合酶的产量达到5764U/g，比原始条件提高了3.4%。

参考文献：

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[12]张树政.酶制剂工业[M].北京：科学出版社，1984.

[13]丁小维，田文婷，张波，等.盐湖微生物Fosmid文库纤维酶克隆的筛选及产酶研究[J].陕西理工学院学报（自然科学版），2016，32（1）：59-63.

作者简介：

温拥军（1980- ），男，硕士，副教授，研究方向：微生物发酵工程。

基金项目：湖南省教育厅科学研究项目（16C0548）