HLA-DP基因多态性与HCV患者抗病毒治疗免疫应答的相关性分析

石菡 李艳芳 袁媛 贾志华 纪风兵

中圖分类号 R511 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2019）22-3112-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.22.18

摘 要 目的：研究HLA-DP基因多态性与丙型肝炎病毒（HCV）患者抗病毒治疗免疫应答的相关性。方法：选取2013年5月-2017年8月于我院就诊的HCV汉族患者106例，所有患者均接受为期48周的聚乙二醇化干扰素α（PEG IFNα）+利巴韦林（RBV）联合治疗，并于停药后接受为期24周的随访。记录其年龄、体质量、HCV-RNA基线水平等一般资料，并采用Taqman-MGB荧光探针实时定量聚合酶链反应法检测其HLA-DP基因rs3077、rs2395309位点的分型。根据治疗结局将患者分为持续病毒学应答组（SVR）和未持续病毒学应答组（N-SVR），采用Logistic回归模型对影响HCV患者抗病毒治疗免疫应答的相关因素（性别、年龄、体质量指数、HCV-RNA基线水平以及基因多态性）进行单因素和多因素分析。结果：106例患者中，rs3077位点CC、CT、TT型频率分别为40.6%、35.8%、23.6%，rs2395309位点GG、GA、AA型频率分别为50.0%、39.6%、10.4%，均符合Hardy-Weinberg遗传平衡（P>0.05）。SVR组患者80例，N-SVR组患者26例;SVR组患者的年龄、rs3077位点CT、TT型以及rs2395309位点GA、AA型比例均显著低于N-SVR组，rs3077位点CC型以及rs2395309位点GG型比例均显著高于N-SVR组（P<0.05）;而两组患者的性别、体质量指数、HCV-RNA基线水平比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。单因素、多因素分析结果显示，患者性别，体质量指数，HCV-RNA基线水平，rs3077位点CC型、rs2395309位点GG型与其抗病毒治疗免疫应答不显著相关（P>0.05），而年龄、rs3077位点CT和TT型、rs2395309位点GA和AA型与其抗病毒治疗免疫应答显著相关[比值比（OR）分别为1.135、1.766、1.283、1.218、1.103，95%置信区间（CI）分别为（1.017，1.267）、（1.007，3.100）、（1.038，1.585）、（1.011，1.467）、（1.038，1.172），P<0.05]。结论：年龄以及HLA-DP基因rs3077、rs2395309位点多态性与HCV汉族患者PEG IFNα+RBV抗病毒治疗免疫应答相关，其中低龄患者可能获得较高的抗病毒免疫应答率，而T、A突变等位基因携带者则可能获得更低的抗病毒免疫应答率。

关键词 丙型肝炎病毒;汉族;HLA-DP基因;基因多态性;rs3077;rs2395309;抗病毒治疗免疫应答;相关性

Correlation Analysis of HLA-DP Gene Polymorphisms with Immune Response to Antiviral Treatment for HCV Patients

SHI Han，LI Yanfang，YUAN Yuan，JIA Zhihua，JI Fengbing（Dept. of Infectious Diseases， the First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College， Chengdu 610500， China）

ABSTRACT   OBJECTIVE： To study the correlation of HLA-DP gene polymorphisms with the immune response to antiviral treatment for hepatitis C virus （HCV） patients. METHODS： A total of 106 HCV Han-nationality patients were collected from our hospital during May 2013 to Aug 2017. All patients received PEG IFNα+ribavirin （RBV） for 48 weeks， and then 24 week follow-up after drug withdrawal. Age， body weight and baseline level of HCV-RNA were recorded. The typing of rs3077 and rs2395309 site of HLA-DP gene were detected by RT-qPCR with Taqman-MGB fluorescent probe. According to treatment outcome， the patients were divided into two groups such as sustained viral response （SVR） group and no-sustained viral response （N-SVR） group. Univariate and multivariate analysis were performed for influential factors （gender， age， body weight index， HCV-RNA baseline level， gene polymorphisms） of immune response to antiviral treatment for HCV patients with Logistic regression model. RESULTS： Among 106 patients， the frequencies of CC， CT and TT genotype at rs3077 site were 40.6%， 35.8% and 23.6%; those of GG， GA and AA genotype at rs2395309 site were 50.0%， 39.6%， 10.4%， respectively， which were in line with Hardy-Weinberg genetic balance （P>0.05）. Totally 80 HCV patients were obtained in SVR group， and 26 HCV patients in N-SVR group. The patients age， the proportion of CT and TT genotype of rs3077 site and GA and AA genotype of rs2395309 site in SVR group were significantly lower than N-SVR group. The proportion of CC genotype at rs3077 site and GG genotype at rs2395309 site were significantly higher than N-SVR group （P<0.05）. There was no statistical significance in gender， body weight index or HCV-RNA baseline level between 2 groups （P>0.05）. Univariate and multivariate analysis showed that gender， body mass index， HCV-RNA baseline level， CC genotype at rs3077 site and GG genotype at rs2395309 site were not related to the immune response to antiviral treatment （P>0.05）. Age， CT and TT genotype at rs3077 site， GA and AA genotype at rs2395309 site were associated with the immune response to antiviral therapy [OR were 1.135， 1.766， 1.283， 1.218， 1.103， 95%CI were （1.017，1.267）， （1.007，3.100）， （1.038，1.585）， （1.011，1.467）， （1.038，1.172）， respectively， P<0.05]. CONCLUSIONS： Age and the polymorphisms of HLA-DP gene at rs3077 and rs2395309 site are related to immune response to PEG IFNα+RBV antiviral treatment for HCV Han-nationality patients. Young patients may have higher antiviral immune response rate， while carriers with T and A mutation alleles may have lower antiviral immune response rate.

KEYWORDS   Hepatitis C virus; Han nationality; HLA-DP gene; Gene polymorphisms; rs3077; rs2395309; Antiviral treatment immune response; Correlation

丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）是肝硬化、肝細胞癌（HCC）、肝脏移植的主要病因。据统计，2015年全球约有七千万人感染HCV，其中我国和印度的感染率较高[1]。目前，聚乙二醇化干扰素α（PEG IFNα）联合利巴韦林（RBV）是治疗HCV感染的首选方案[2]。然而，由于病毒基因差异、环境恶化、患者个体及遗传差异等因素导致部分接受抗病毒治疗的患者无法获得持续病毒学应答（SVR）[3]。有研究报道，携带特定基因型（如IL-28B基因 rs12979860位点CC型、rs8099917位点TT型）的患者在接受抗病毒治疗时具有更高的HCV清除率，且最终可获得较高的SVR[4]。同时，近年研究指出，HLA- DP基因多态性与HCV感染及患者转归密切相关[5]。为进一步提高HCV的治疗有效率，本研究系统分析了HCV患者HLA-DP基因多态性与其抗病毒治疗免疫应答的相关性，以期为HCV的精准治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2013年5月-2017年8月于我院确诊并接受PEG IFNα+RBV抗病毒治疗的HCV患者106例。纳入标准：（1）根据《丙型肝炎防治指南（2015年更新版）》[6]诊断为HCV的汉族患者;（2）HCV-RNA（即病毒载量）≥3 logIU/mL;（3）临床病历资料完整。排除标准：（1）妊娠期或哺乳期妇女;（2）合并乙型肝炎病毒（HBV）、人类免疫缺陷病毒（HIV）感染者;（3）其他类型病毒感染者;（4）自身免疫性疾病患者;（5）精神疾病患者;（6）病情未能控制的癫痫患者;（7）酗酒或吸毒者;（8）失代偿期肝硬化者;（9）心脏病患者;（10）治疗前粒细胞<1.0×109 L-1、血小板<50×109 L-1、血红蛋白<80 g/L者;（11）器官移植急性期（肝移植除外）者;（12）肾功能不全者。本研究方案经医院医学伦理委员会审核批准，所有患者均对本研究知情并签署了知情同意书。记录所有患者入院时的一般资料（如性别、年龄、体质量等）和临床资料（有无基础疾病、病毒载量等）。

1.2 研究方法

1.2.1 治疗方法 所有患者均接受聚乙二醇干扰素α-2a注射液（瑞士Roche Registration Ltd.，注册证号：S20120049，规格：180 μg/0.5 mL）180 μg/次，每周1次，皮下注射，并按如下方案调整剂量：当患者中性粒细胞为0.5×109～0.75×109 L-1时，该药用量降至135或90 μg/次，每周1次;当患者中性粒细胞持续下降且低于0.5×109 L-1时，停用该药1～2次，并联合使用重组人粒细胞集落刺激因子注射液[哈药集团生物工程有限公司，批准文号：国药准字S20050047，规格：18 000 000 IU（300 μg）/支]100 μg/m2，每日1次，皮下注射，调节中性粒细胞至0.75×109 L-1后再继续干扰素治疗。在此基础上，所有患者均口服利巴韦林片（石药集团欧意药业有限公司，批准文号：国药准字H20056469，规格：50 mg）400 mg，每日2次。所有患者均连续治疗48周，并于停药后接受为期24周的随访。

1.2.2 血清HCV抗体以及病毒载量检测 分别于治疗前、治疗中及治疗结束后24周（即第0、4、12、24、48、72周，下同）抽取患者静脉血5 mL，以3 000 r/min离心10 min，分离血清，置于-70 ℃保存，备用。使用酶联免疫吸附法以WM 1000型酶联免疫检测仪（北京中西远大科技有限公司）检测患者血清HCV抗体;使用荧光探针法以7900HT型实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）仪（美国ABI公司，下同）定量测定HCV-RNA水平。所用HCV抗体检测试剂盒、HCV-RNA检测试剂盒分别由杭州隆基生物技术有限公司、湖南圣湘生物科技有限公司提供，严格按照其说明书操作。

1.2.3 HLA-DP基因分型检测 采用Taqman-MGB荧光探针实时定量PCR法以7900HT型实时荧光定量PCR仪对HLA-DP基因rs3077和rs2395309两个位点的分型进行扩增，探针和引物序列如表1所示（表中，“FAM”“HEX”分别为6-羧基荧光素和六氯-6-甲基荧光素探针5′端荧光基团，“MGB”为小沟结合探针3′端荧光猝灭基团，“P-G/A/C/T”为磷酸化碱基对）。反应体系（总体积5 μL）：2×PCR MaterMix 2.5 μL，10 ng/μL DNA模板1 μL，20 pmol/μL上、下游引物各0.225 μL，10 pmol/μL探针0.125 μL，用ddH2O加至5 μL。反应条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸40 s，共40个循环;72 ℃再延伸5 min。运用7900HT型实时荧光定量PCR仪和配套SDS 2.3软件对扩增结果进行分析。根据荧光信号确定基因型，当含有FAM或HEX的探针与待测序列互补时，FAM或HEX的荧光基团被游离，仪器检测到荧光信号，其中FAM荧光信号表示含C、G等位基因，HEX荧光信号表示含A、T等位基因。当仅有FAM信号时，代表纯合子CC或GG;当仅有HEX信号时，代表纯合子AA或TT;当FAM和HEX信号同时增强时，代表杂合子CT或GA。

1.2.4 其他指标 分别于第0、4、12、24、48、72周对患者血常规、血清肌酐、磷酸肌酐、肝功能、甲胎蛋白等实验室指标进行评测。

1.2.5 疗效评估 （1）快速病毒学应答（RVR）：治疗4周内，未检测到HCV-RNA;（2）早期病毒学应答（EVR）：治疗12周时，HCV-RNA水平低于最低检测限（3 logIU/mL，下同）或降低2个数量级以上;（3）治疗结束病毒学应答（ETVR）：治疗结束时，HCV-RNA水平低于最低检测限;（4）SVR：治疗结束至随访24周内，HCV-RNA水平低于最低檢测限;（5）复发（Relapse）：有ETVR，但停药后HCV-RNA检测为阳性;（6）无应答（NR）：无EVR、ETVR;（7）未持续病毒学应答（N-SVR）：将复发和NR统称为N-SVR[6]。根据治疗结局（即末次随访时的疗效）将患者分为SVR组和N-SVR组。

1.2.6 统计学方法 采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。采用χ2检验进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验。计数资料以例数或率表示，组间比较采用χ2检验;计量资料以x±s表示，组间比较采用成组t检验。采用Logistic回归模型对影响患者抗病毒治疗免疫应答的相关因素进行单因素和多因素分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者一般资料

106例患者均无酗酒史，其中男性62例、女性44例，平均年龄（42.33±14.51）岁，平均体质量指数（BMI）（23.00±2.23）kg/m2，HCV-RNA基线水平（5.56±0.93）logIU/mL。

2.2 患者Hardy-Weinberg遗传平衡检验结果

HLA-DP基因rs3077、rs2395309位点基因型频率的观察值与理论值吻合良好，其分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡（P>0.05），表明所选样本具有人群代表性，详见表2。

2.3 SVR和N-SVR组患者基本资料比较结果

106例HCV患者均完成了48周的抗病毒治疗和治疗后为期24周的随访，其中有80例患者获得SVR（即SVR组），26例患者未获得SVR（即N-SVR组）。基线资料比较结果显示，两组患者的性别、BMI、HCV-RNA基线水平差异均无统计学意义（P>0.05）;而SVR组患者的年龄显著低于N-SVR组，且两组患者HLA-DP基因rs3077、rs2395309位点各基因型患者比例差异均有统计学意义（P<0.05），其中SVR组患者rs3077位点CT、TT型以及rs2395309位点GA、AA型患者比例均显著低于N-SVR组，而CC型和GG型患者比例均显著高于N-SVR组（P<0.05），详见表3。

2.4 影响HCV患者抗病毒治疗免疫应答的单因素和多因素分析结果

80例获得SVR患者的单因素和多因素分析结果见表4、表5。其中，患者性别、BMI、HCV-RNA基线水平、rs3077位点CC型、rs2395309位点GG型与其抗病毒治疗免疫应答不显著相关（P>0.05），而年龄、rs3077位点CT、TT型以及rs2395309位点GA、AA型与其抗病毒治疗免疫应答显著相关（P<0.05）。

3 讨论

HCV为全球流行性疾病，每年感染率约为1.0%，且易感人群不分种族、年龄、性别[1]。HCV主要由血制品、输血和单采血浆还输血细胞等途径经破损黏膜和皮肤传播，感染隐匿，大多数患者尚无明显症状就已被感染[6]。HCV感染进一步可能发展为失代偿期肝硬化、HCC和肝衰竭，严重威胁人群健康。抗病毒治疗是清除HCV的首选治疗手段，其中PEG IFNα联合RBV为目前临床最常用的治疗方案[7]。尽管经PEG IFNα+RBV抗病毒治疗后，约有50%～80%的患者能获得SVR，然而有研究指出，HCV抗病毒治疗免疫应答受多种因素的影响，低龄（青年）、女性、白种人群HCV患者可获得较高的SVR率[8-10]。

基因多态性是指在一个生物群体中，同时或经常存在两种或多种不连续的变异型或基因型或等位基因，亦称遗传多态性，是产生个体差异的重要基础。基因多态性一方面可能与遗传病病因明显关联，另一方面可能与直接导致疾病的基因密切相关，通过对随机选取健康组和病例组某些特定基因位点的等位基因发生频率进行比较的关联分析法是目前常用的基因多态性研究方法之一[11]。既往研究发现，位于人19号染色体的IFNL4基因具有5个外显子和4个内含子，其中位于第1外显子上的rs368234815位点与HCV患者的免疫应答有关，相较于非TT/TT型携带者，TT/TT型患者可获得更高的SVR[12]。除该多态性位点外，韦娟等[13]发现HLA-DP基因的多态性与HCV感染转归相关。人类白细胞抗原DP（HLA-DP）蛋白在介导CD4+T细胞免疫过程中起到抗原信号传递的作用，可调控病原体免疫反应。其中，单核苷酸rs3077位点与HLA-DP蛋白a链的编码有关，当野生CC型发生突变后，其编码的HLA-DP蛋白活性将明显下降[14];而rs2395309位于HLA-DP基因3′非编码区，当野生GG型发生突变后，将影响靶基因mRNA 3′端的互补匹配，从而改变RNA诱导沉默复合体的稳定性，使下游HLA-Ⅱ类抗原的表达受到影响，最终影响患者抗病毒免疫功能;与上述位点野生型携带者相比，突变型携带者自身病毒清除能力有所降低，病毒感染风险将有所增高[15]。基于此，本研究系统分析了HLA-DP基因多态性对HCV患者PEG IFNα+RBV抗病毒治疗免疫应答的影响。

本研究以106例HCV患者为研究对象，其经PEG IFNα+RBV抗病毒治疗后，有80例（75.5%）获得SVR，26例（24.5%）未获得SVR。笔者分析、比较SVR组和N-SVR组患者的基线资料发现，两者在性别、BMI、HCV-RNA基线水平等方面均无显著差异，而SVR组患者的平均年龄显著低于N-SVR组。此外，运用Taqman-MGB荧光探针实时定量PCR法对两组患者HLA-DP基因rs3077、rs2395309位点的分型进行检测，结果显示，SVR组和N-SVR患者HLA-DP基因上述两个位点的基因型频率均存在显著差异。这提示患者年龄、HLA-DP基因rs3077、rs2395309位点多态性可能与HCV患者抗病毒治疗免疫应答有关。

基于现有文献所述，低龄、女性、白种人群HCV患者可能获得更高SVR率，且HLA-DP基因rs3077、rs2395309位点多态性可能影响HCV患者的转归[8-10， 14-15]，故本研究在基线资料比较的基础上，进一步对可能影响HCV患者抗病毒治疗免疫应答的因素进行了Logistic单因素、多因素分析。结果显示，年龄[OR=1.135，95%CI（1.017，1.267）]、HLA-DP基因rs3077位点CT、TT型[OR分别为1.766、1.283，95%CI分別为（1.007，3.100）、（1.038，1.585）]以及rs2395309位点GA、AA型[OR分别为1.218、1.103，95%CI分别为（1.011，1.467）、（1.038，1.172）]均为HCV患者抗病毒治疗免疫应答的独立危险因素（P<0.05）。

李剑萍等[16]对接受PEG IFNα+RBV抗病毒治疗的HCV患者疗效的影响因素进行了深入分析，发现患者年龄与其治疗后是否能获得SVR密切相关，且低龄者的SVR获得率显著高于高龄患者（P=0.001），与本研究结果相似。分析其原因，可能为HCV患者年龄越小，其疾病慢性化概率越低;反之年龄越大，则慢性化概率越高，疾病进展的风险也随之增加;此外，高龄患者在感染时通常伴有其他基础疾病，加之自身机能退化、外周血中免疫细胞（如CD4+T细胞、树突状淋巴细胞等）数量减少、机体耐受力减弱，使得抗病毒治疗药物的使用剂量和疗程受到一定限制，最终影响了抗病毒治疗的效果[17]。除年龄之外，本研究亦发现HLA-DP基因rs3077、rs2395309位点的多态性与患者的免疫应答相关，其中rs3077位点TT、TC型以及rs2395309位点GA、AA型均可增加个体感染HCV的风险，与韦娟等[13]研究结果基本一致。该研究还指出，HLA-DP基因上述位点多态性与HCV感染风险和自身清除有关，但其在感染转归中的具体机制尚不明确，有待对其分子生物学功能进行进一步探索。本研究结果提示，HCV患者在接受抗病毒治疗之前，可根据HLA-DP基因型进行个体化治疗，以避免医疗资源浪费并提高抗HCV治疗效果、改善患者预后。

综上所述，年龄以及HLA-DP基因rs3077、rs2395309位点多态性与HCV汉族患者PEG IFNα+RBV抗病毒治疗免疫应答相关，低龄患者可能获得较高的抗病毒免疫应答率，而T、A突变等位基因携带者则可能获得更低的抗病毒免疫应答率。但由于HLA-DP基因在HCV感染及病情进展中的具体机制尚不清楚，且本研究样本量较小、类型单一，故上述结论仍需具多样性的大样本研究予以验证。

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（收稿日期：2018-12-14 修回日期：2019-09-08）

（编辑：张元媛）