雷公藤甲素—甘草次酸复方微乳的制备及其理化性质和体外释药特性研究

郑恒 李晓东 翟晓莹 董淑英 张铎 杨瑞

摘 要 目的：建立雷公藤甲素-甘草次酸复方微乳的含量测定方法，优化其处方，并考察其理化性质及体外释药特性。方法：采用超高效液相色谱法测定雷公藤甲素-甘草次酸复方微乳的含量，色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18，流动相为0.1%甲酸水溶液-乙腈（梯度洗脱），流速为0.4 mL/min，柱温为40 ℃，检测波长为218 nm，进样量为5 μL。采用水滴定法绘制伪三元相图，以油相、表面活性劑、助表面活性剂为指标优化处方；采用体外释放试验考察所制微乳的体外释放特性。结果：雷公藤甲素、甘草次酸的检测质量浓度线性范围分别为1～40 μg/mL（r=0.999 7）、10～400 μg/mL（r=0.999 8）；定量限分别为0.5、0.8 μg/mL，检测限分别为0.1、0.2 μg/mL；精密度、稳定性、重复性试验的RSD均小于2%；加样回收率分别为100.32%～101.15%（RSD=0.36%，n=6）、99.78%～101.42%（RSD=0.59%，n=6）。最优处方为以中链甘油三酯为油相，聚乙二醇羟基硬脂酸酯为表面活性剂，无水乙醇为助表面活性剂，水为水相，四者质量比为8 ∶ 28 ∶ 14 ∶ 50。所制微乳为水包油型，外观透明澄清，其平均粒径为（62.38±3.44）nm，平均多分散指数为0.096±0.001，平均黏度为（26.84±1.10）mPa·S。所制微乳在24 h内的雷公藤甲素、甘草次酸累积释放度分别为99.8%、99.7%（pH 2.0的磷酸缓冲盐溶液中），99.3%、99.4%（pH 7.4的磷酸缓冲盐溶液中），98.9%、98.4%（pH 9.0的磷酸缓冲盐溶液中）；单方微乳中的雷公藤甲素和甘草次酸释放均快于复方微乳。结论：所建含量测定方法操作简便、准确；所得优化处方稳定、可行；所制雷公藤甲素-甘草次酸复方微乳较单方微乳具有更好的缓释作用。

关键词 雷公藤甲素；甘草次酸；复方微乳；超高效液相色谱法；伪三元相图；处方优化；体外释放度

Study on Preparation of Triptolide-glycyrrhetic Acid Compound Microemulsion and Its Physicochemical Properties and in vitro Release Characteristics

ZHENG Heng1，LI Xiaodong1，ZHAI Xiaoying1，DONG Shuying1，ZHANG Duo1，YANG Rui2（1. Dept. of Dermatology， Central Hospital Affiliated to Shenyang Medical College， Shenyang 110024， China； 2. Academy of Traditional Chinese Medicine of Liaoning Province， Shenyang 110034， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish content determination method of Triptolide-glycyrrhetic acid compound microemulsion， optimize the formula and investigate its physicochemical properties and release rate in vitro. METHODS： The content of Triptolide- glycyrrhetic acid compound microemulsion was determined by UPLC. The determination was performed on ACQUITY UPLC BEH C18 column with mobile phase consisted of 0.1% formic acid aqueous solution-acetonitrile （gradient elution） at the flow rate of 0.4 mL/min. The column temperature was 40 ℃. The detection wavelength was set at 218 nm， and sample size was 5 μL. Pseudo-ternary phase diagrams were drawn by water titration method. Using oil phase， surfactants and co-surfactants as index， the formula was optimized， and in intro release characteristics was investigated by in vitro release test. RESULTS： The linear range of triptolide and glycyrrhetinic acid were 1-40 μg/mL（r=0.999 7） and 10-400 μg/mL（r=0.999 8）， respectively. The limits of quantitation were 0.5 and 0.8 μg/mL； the limits of detection were 0.1 and 0.2 μg/mL. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all less than 2%. Average recoveries were 100.32%-101.15% （RSD=0.36%， n=6）， 99.78%-101.42% （RSD=0.59%，n=6）. The optimal formula included that medium chain triglyceride as oil phase， polyethylene glycol hydroxy stearate as surfactants， ethanol as co-surfactants， water as water phase， the proportion of them was 8 ∶ 28 ∶ 14 ∶ 50. The obtained microemulsion was O/W type， being transparent and clear， with average diameter， average polydispersity index and average viscosity of （62.38±3.44） nm， 0.096±0.001 and （26.84±1.10） mPa·S. Within 24 h， cumulative release rates of triptolide and glycyrrhetinic acid in obtained microemulsion were 99.8% and 99.7% （in PBS pH 2.0）， 99.3% and 99.4% （in PBS pH 7.4）， 98.9% and 98.4% （in PBS pH 9.0）， respectively. Triptolide and glycyrrhetinic acid released faster in the single microemulsion than in the compound microemulsion. CONCLUSIONS： Established content determination method is simple and stable. The optimized formula is stable and feasible. Obtained iriptolide-glycyrrhetinic acid compound microemulsion show better sustained-release effect than sigle microemulsion.

KEYWORDS Triptolide；Glycyrrhetic acid；Compound microemulsion；UPLC； Pseudo-ternary phase diagrams； Formula optimization； in vitro release rate

雷公藤为卫矛科雷公藤属植物雷公藤（Tripterygium wilfordii）多年生藤本植物，味苦、辛，性寒，有剧毒，具有免疫抑制作用[1]。雷公藤广泛应用于血管炎[2]、红斑狼疮[3]、湿疹[4]、银屑病[5]、系统性硬皮病[6]、过敏性紫癜[7]、结节性红斑[8]、皮肤淀粉样变[9]、白塞病[10]等皮肤病以及肾病[11]、类风湿性关节炎[12]的治疗，效果显著。但雷公藤为有毒中药，其活性成分雷公藤甲素具有明显的生殖毒性[13]和肝肾毒性[14]。有数据统计显示，雷公藤制剂用药后的不良反应发生率高达11.7%[14]。古语云：“甘草解百毒”。现代研究表明，甘草可在一定程度上拮抗雷公藤的毒性并提高疗效，体现出了中药配伍减毒增效的中医药特色优势[11，15]。为此，本研究将雷公藤的主要活性成分雷公藤甲素和甘草的主要活性成分甘草次酸制成雷公藤甲素-甘草次酸复方微乳，以期通过配伍来降低雷公藤甲素的毒性，并利用纳米制剂粒径小、生物相容性好的优势，达到减毒增效的目的。在此基础上，笔者采用超高效液相色谱法（UPLC）测定了雷公藤甲素-甘草次酸复方微乳的含量，优化其制备处方，并考察所制微乳的相关理化性质及体外释放度，旨在为雷公藤相关制剂的开发以及临床用药安全性的提高提供参考。

1 材料

1.1 仪器

ACQUITY UPLCTM型UPLC仪，包括ACQ-QSM四元泵、ACQ-FTN自动进样器、ACQ二极管阵列检测器、Empower 3 色谱工作站（美国Waters公司）；XW-80A型微型旋涡混合仪（上海沪西分析仪器厂有限公司）；XS105型十万分之一电子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；DF-101S型集热式恒温磁力搅拌器（巩义市英峪予华仪器厂）；Milli-Q Reference型超纯水系统（德国Merck公司）；Zetasizer Nano ZS90型激光粒度仪（英国Malvern仪器公司）；NDJ-1 型旋转式黏度计（上海天平仪器厂）；透析袋（截留分子量为8 000～14 000 Da，北京索莱宝科技有限公司）。

1.2 药品与试剂

雷公藤甲素对照品（批号：111567-200502，纯度：99.8%）、甘草次酸对照品（批号：110723-200612，纯度：99.6%）均由中国食品药品检定研究院提供；雷公藤甲素原料药（南京泽朗医药科技有限公司，批号：130708，纯度：>98.0%）；甘草次酸原料药（大连美仑生物技术有限公司，批号：140113，纯度：>98.0%）；大豆油（营口渤海油脂工业有限公司，批号：20121205）；油酸乙酯（北京长城化学试剂厂，批号：101106）；中链甘油三酯（批号：111006）、辛酸/癸酸甘油三酯（批号：58653-35）、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯（批号：100501）、二乙二醇单乙基醚（批号：100302）均购自法国Gattefosse公司；肉豆蔻异丙酯（批号：120612）、棕榈酸异丙酯（批号：120908）均购自浙江兰溪物美化工有限公司；聚氧乙烯氢化蓖麻油（批号：145179）、聚乙二醇羟基硬脂酸酯（批号：29749816K0）均购自德国BASF公司；聚山梨酯20（批号：061016）、聚山梨酯80（批号：060409）均购自英国CRODA公司；无水乙醇（批号：20110311）、丙二醇（批号：20090504）、聚乙二醇200（批号：20090603）、聚乙二醇400（批号：201008006）均购自天津市百世化工有限公司；磷酸（批号：20140915）、磷酸氢二钠（批号：20090812）、磷酸二氢钾（批号：20120513）、氢氧化钠（批号：20160922）、硼酸（批号：20110706）均购自国药集团化学试剂有限公司；氯化钾（北京燕京药业有限公司，批號：1507031）；亚甲蓝（北京化学试剂公司，批号：070609）；苏丹红Ⅲ（德国Dr. Ehrenstorfer公司，批号：40517）；乙腈、甲酸均为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为自制超纯水。

2 方法与结果

2.1 雷公藤甲素-甘草次酸复方微乳的制备

精密称取油相、表面活性剂及助表面活性剂各适量，置于具塞西林瓶中，室温下以磁力搅拌（30 r/min，下同），混合均匀，然后加雷公藤甲素原料药12.5 mg、甘草次酸原料药125 mg，待完全溶解后缓慢加水50 mL，磁力搅拌1 h，即得雷公藤甲素-甘草次酸复方微乳。

2.2 雷公藤甲素-甘草次酸复方微乳中主成分的含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～5 min，10%B→60%B；5～13 min，60%B→90%B；13～15 min，90%B）；流速：0.4 mL/min；柱温：40 ℃；检测波长：218 nm；进样量：5 μL。在该色谱条件下，分离度均大于1.5，理论板数均不低于3 000，阴性样品对测定无干扰，详见图1。

2.2.2 混合对照品溶液的制备 精密称取雷公藤甲素对照品、甘草次酸对照品各10 mg，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，即得质量浓度均为1 mg/mL的单一对照品贮备液。分别精密量取上述雷公藤甲素对照品贮备液0.5 mL、甘草次酸对照品贮备液5 mL，置于同一10 mL量瓶中，加流动相稀释制成含0.05 mg/mL雷公藤甲素、0.5 mg/mL甘草次酸的混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取雷公藤甲素-甘草次酸复方微乳1 g，置于10 mL量瓶中，加流动相溶解并定容，摇匀，滤过，即得。

2.2.4 阴性样品溶液的制备 按雷公藤甲素-甘草次酸复方微乳的制备工艺，制备不含雷公藤甲素和甘草次酸的阴性样品，再按“2.2.3”项下方法制备阴性样品溶液，即得。

2.2.5 线性关系考察 取“2.2.2”项下混合对照品溶液适量，加流动相稀释制成含雷公藤甲素分别为1、2、5、10、20、40 μg/mL，甘草次酸分别为10、20、50、100、200、400 μg/mL的系列线性关系工作溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定。以待测成分质量浓度（x，μg/mL）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得雷公藤甲素回归方程为y=4.023×104x-5.385×103（r=0.999 7）、甘草次酸回归方程为y=2.683×104x+4.366×103（r=0.999 8）。结果表明，雷公藤甲素、甘草次酸的检测质量浓度线性范围分别为1～40、10～400 μg/mL。

2.2.6 定量限与检测限考察 精密吸取“2.2.2”项下各单一对照品贮备液适量，以流动相倍比稀释，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，以信噪比为10 ∶ 1、3 ∶ 1分别计算定量限、检测限。结果，雷公藤甲素、甘草次酸的定量限分别为0.5、0.8 μg/mL，检测限分别为0.1、0.2 μg/mL。

2.2.7 精密度试验 取“2.2.2”项下混合对照品溶液适量，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样测定6次。结果，雷公藤甲素、甘草次酸峰面积的RSD分别为0.55%、1.12%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.2.8 稳定性试验 取“2.2.3”项下供试品溶液适量，分别于室温下放置0、1、2、4、6、8、10 h时按“2.2.1”项下色谱条件进样测定。结果，雷公藤甲素、甘草次酸峰面积的RSD分别为0.84%、0.57%（n=7），表明供试品溶液于室温下放置10 h内稳定性良好。

2.2.9 重复性试验 取雷公藤甲素-甘草次酸复方微乳适量，共6份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，以峰面积按回归方程计算样品中雷公藤甲素、甘草次酸的含量。结果，雷公藤甲素、甘草次酸的平均含量分别为0.125 2、1.245 0 mg/g，RSD分别为1.42%、1.15%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.2.10 加样回收率试验 精密称取已知含量的雷公藤甲素-甘草次酸复方微乳1 g，共6份，加入一定量的各单一对照品贮备液，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，以峰面积按回归方程计算加样回收率，结果见表1。

2.2.11 样品含量测定 取3批雷公藤甲素-甘草次酸复方微乳各适量，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，以峰面积按回归方程计算样品中雷公藤甲素、甘草次酸的含量。结果，雷公藤甲素的含量为0.122 7～0.126 8 mg/g、甘草次酸的含量为1.216 0～1.258 3 mg/g。

2.3 雷公藤甲素-甘草次酸复方微乳的处方优化

2.3.1 油相的筛选 分别考察雷公藤甲素、甘草次酸在不同油相中的溶解度，详见表2。由表2可知，雷公藤甲素、甘草次酸在中链甘油三酯中溶解度最高，为保证雷公藤甲素-甘草次酸复方微乳中有较高的载药量，故选择中链甘油三酯为油相。

2.3.2 表面活性剂与助表面活性剂种类的筛选 分别以聚山梨酯20、聚山梨酯80、聚氧乙烯氢化蓖麻油、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯和聚乙二醇羟基硬脂酸酯为表面活性剂，无水乙醇为助表面活性剂，将表面活性剂和助表面活性剂按质量比1 ∶ 1（Km值）混合后，与中链甘油三酯按不同质量比（9 ∶ 1、8 ∶ 2、7 ∶ 3、6 ∶ 4、5 ∶ 5、4 ∶ 6、3 ∶ 7、2 ∶ 8、1 ∶ 9）于西林瓶中混合均匀，于磁力搅拌下用水进行滴定，同时記录体系由混浊变为澄清透明时的临界点。按中链甘油三酯、混合表面活性剂、水在临界点时各自的质量百分数（w/w），绘制伪三元相图，确定微乳的成乳区域，详见图2（图中“ME”表示微乳成乳区域，下同）。由图2可知，表面活性剂为聚乙二醇羟基硬脂酸酯时微乳的成乳区最大。

以聚乙二醇羟基硬脂酸酯为表面活性剂，无水乙醇、丙二醇、聚乙二醇200、聚乙二醇400和二乙二醇单乙基醚为助表面活性剂，将表面活性剂和助表面活性剂按质量比1 ∶ 1（Km值）混合后，与中链甘油三酯按不同质量比（9 ∶ 1、8 ∶ 2、7 ∶ 3、6 ∶ 4、5 ∶ 5、4 ∶ 6、3 ∶ 7、2 ∶ 8、1 ∶ 9）于西林瓶中混合均匀，于磁力搅拌下用水进行滴定，同时记录体系由混浊变为澄清透明时的临界点。按中链甘油三酯、混合表面活性剂、水在临界点时各自的质量百分数（w/w），绘制伪三元相图，确定微乳的成乳区域，详见图3。由图3可知，助表面活性剂为无水乙醇时微乳的成乳区最大。

2.3.3 表面活性剂与助表面活性剂质量比的确定 分别考察表面活性剂与助表面活性剂不同质量比（Km值，1 ∶ 3、1 ∶ 2、1 ∶ 1、2 ∶ 1、3 ∶ 1）对微乳形成的影响，详见图4。由图4可知，随着Km值增大，微乳成乳区增大；当Km值大于2时，微乳成乳区变小，其原因为当表面活性剂与助表面活性剂为最佳质量比时，助表面活性剂可正好完全镶嵌到表面活性剂中，此时形成的微乳结构中增溶空间最大、载油量最大。由此可见，当Km为2时微乳成乳区大小最佳，故确定Km为2 ∶ 1。

2.3.4 最优处方的确定 最优处方为：表面活性剂为聚乙二醇羟基硬脂酸酯，助表面活性剂为无水乙醇，油相为中链甘油三酯，水相为纯水，四者质量比为28 ∶ 14 ∶ 8 ∶ 50。

2.3.5 验证试验 按上述最优处方，平行制备3批雷公藤甲素-甘草次酸复方微乳，依法测定主成分含量进行验证，结果见表3。由表3可知，最优处方稳定、可行。

2.4 雷公藤甲素-甘草次酸复方微乳的理化性质考察

2.4.1 外观 按最优处方制备所得雷公藤甲素-甘草次酸复方微乳为透明澄清的液体。

2.4.2 微乳类别 采用染色法[16]鉴别微乳的类别。按最优处方制备雷公藤甲素-甘草次酸复方微乳2批，分别加苏丹红Ⅲ染料和亚甲蓝染料，静置24 h，肉眼观察染料在微乳中的扩散速度。结果，微乳中蓝色染料（水溶性）的扩散速度大于红色染料（油溶性）。由此判定，雷公藤甲素-甘草次酸复方微乳为水包油型微乳。

2.4.3 粒径 按最优处方制备雷公藤甲素-甘草次酸复方微乳3批，加水稀释至一定浓度，采用激光粒度仪测定其粒径。结果，雷公藤甲素-甘草次酸复方微乳的平均粒径为（62.38±3.44）nm，多分散指数为0.096±0.001，表明该微乳粒径小且分布均匀。

2.4.4 黏度 按最优处方制备雷公藤甲素-甘草次酸复方微乳3批，于25 ℃采用黏度计测定其黏度。结果，雷公藤甲素-甘草次酸复方微乳的平均黏度为（26.84±1.10）mPa·s。

2.5 雷公藤甲素-甘草次酸复方微乳的体外释药试验

采用透析法[17]进行体外释药试验。取雷公藤甲素-甘草次酸复方微乳2 g，放入经处理的透析袋中，扎紧透析袋两端，将透析袋放入含有1%聚山梨酯80的释放介质[pH 2.0的磷酸缓冲盐溶液（PBS）（模拟胃液环境）、pH 7.4的PBS（模拟结肠环境）、pH 9.0的PBS（模拟大肠环境）]100 mL中。另取与雷公藤甲素-甘草次酸复方微乳浓度相同的雷公藤甲素混悬液、甘草次酸混悬液、不含甘草次酸的雷公藤甲素微乳及不含雷公藤甲素的甘草次酸微乳作为对照。设定温度（37±0.5）℃，转速100 r/min，进行体外释放试验。分别于0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24 h取样1 mL，同时补充同温度、等体积的新鲜释放介质。样品溶液经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算药物累积释放度，以时间（h）为横坐标、药物累积释放度（%）为纵坐标，绘制释放曲线，详见图5。结果，24 h内，雷公藤甲素、甘草次酸的累积释放度分别为99.8%、99.7%（pH 2.0的PBS中），99.3%和99.4%（pH 7.4的PBS中），98.9%、98.4%（pH 9.0的PBS中），相比于单方微乳具有缓释作用。

将雷公藤甲素-甘草次酸复方微乳的体外释放数据分别采用零级动力学方程、一级动力学方程、Higuchi 方程和Weibull 方程进行拟合。结果显示，雷公藤甲素在pH 2.0的PBS中释放符合Weibull方程，在pH 7.4、pH 9.0的PBS中的释放均符合一级动力学方程；甘草次酸在pH 2.0、pH 7.4、pH 9.0的PBS中释放均符合一级动力学方程，详见表4。

3 讨论

甘草具有清热解毒、止咳祛痰、补脾和胃、调和诸药的功效[18]。甘草解毒作用最早记载于《神农本草经》：“倍力气，金疮肿，解毒”[19]；《本草纲目》中也有记载：“诸药中甘草为君，治七十二种乳石毒，解一千二百种草木毒”[19]；《千金方》记载：“解百草毒，如汤沃雪，甘草入腹即定，验如反掌”，故有“国老”之号[20]。有研究发现，甘草解毒的主要活性成分为甘草甜素及其水解产生的甘草次酸和葡萄糖醛酸[19]。甘草中的活性成分可与毒性化合物形成络合物[21]发挥肾上腺皮质激素样作用[22]、缓解中毒症状[23]、抗微生物毒素[24]、诱导P糖蛋白表达等功能[25]。甘草次酸为甘草酸的水解产物，是甘草的主要药效成分，具有抗过敏[26]、免疫调节[27]、抗肿瘤[28]、解毒保肝[29]、抗氧化[30]等作用，临床常用其替代激素类药物治疗免疫类疾病、癌症，与其他药物联用可有效治疗神经性皮炎、慢性湿疹、慢性荨麻疹、斑秃等皮肤疾病[31]。

微乳是由水相、油相、表面活性剂和助表面活性剂按一定比例混合制成的均勻、透明、各向同性和热力学稳定的分散体系。微乳处方中亲脂性成分比例较大，具有良好的生物相容性，加之粒径小、比表面积大、吸收迅速完全，因此具有广阔的研发前景[17]。

本研究采用UPLC法测定雷公藤甲素-甘草次酸复方微乳中雷公藤甲素和甘草次酸的含量，该方法专属性强、灵敏度高、准确性好。另外，通过雷公藤甲素和甘草次酸在不同油相中的溶解度，确定了中链甘油三酯为油相；通过伪三元相图成乳区域大小确定了聚乙二醇羟基硬脂酸酯为表面活性剂、无水乙醇为助表面活性剂，且Km为2 ∶ 1时微乳成乳区域最大。最终确定最优处方为表面活性剂为聚乙二醇羟基硬脂酸酯，助表面活性剂为无水乙醇，油相为中链甘油三酯，水相为水，四者质量比为28 ∶ 14 ∶ 8 ∶ 50。以此处方制得微乳的外观透明澄清、粒径均匀。

体外释放试验结果显示，单方微乳中2种主成分的释放速度均快于复方微乳，推测原因可能为雷公藤甲素与甘草次酸形成了络合物，使释放速度减慢，而达到减毒的功效。此外，基于甘草次酸的抗过敏、免疫调节作用，本研究制备的雷公藤甲素-甘草次酸复方微乳可在免疫性疾病的治疗中起到双重调节作用，具有减毒增效的双重作用[30]，为有毒中药的临床应用提供了新的研究思路。

综上所述，本研究所建含量测定方法操作简便、准确，所得优化处方稳定、可行，所制雷公藤甲素-甘草次酸复方微乳较单方微乳具有更好的缓释作用。

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（收稿日期：2019-01-04 修回日期：2019-04-27）

（编辑：陈 宏）