夏季桉树枝瘿姬小蜂雌成虫体内可培养细菌的分离与鉴定

王蕊蕊，胡 颖，杨振德,2，郭春晖，彭 欣，郑霞林，张海欧

（1.广西大学林学院，南宁 530004；2.广西森林生态与保育重点实验室，南宁 530004；3.广西大学农学院，南宁 530004；4.攀枝花市森林病虫防治检疫站，四川攀枝花 617000）

桉树枝瘿姬小蜂（Leptocybe invasa），属于膜翅目（Hymenoptera），小蜂总科（Chalcidoidea），姬小蜂科（Eulophidae），是严重危害桉属植物枝叶的致瘿性害虫[1]。该害虫起源于澳大利亚，最早于2000年在中东和地中海地区被发现，现已扩散至亚洲、欧洲、非洲、美洲及大洋洲的45 个国家，给桉树产业发展造成了严重的经济损失[2]。目前，国内外对桉树枝瘿姬小蜂的研究主要集中在生物学、生态学、生理学和综合治理等方面[3-4]，对桉树枝瘿姬小蜂体内可培养细菌的研究鲜有报道。

昆虫体内栖居着种类繁多、数量巨大的微生物群落，这些微生物与宿主昆虫在长期协同进化过程中，形成了丰富多样的种群结构和生物学功能，对宿主的生长发育、营养代谢、生殖、行为、抗性等方面都产生了显著的影响，同时在害虫的防控、昆虫资源的利用及生物能源的生产等领域具有较大的应用潜力[5-7]。随着现代分子生物技术的快速发展和应用，16S rDNA 基因序列分析技术、DGGE 技术、高通量测序技术和宏基因组学等已成为研究微生物较常用的方法，并得到了较传统微生物分离鉴定法更为全面、准确的菌群结构信息，但不能解析哪些菌为可培养或不可培养细菌，若想用生物学试验验证体内细菌对宿主的生理功能和生态作用及开发利用体内细菌资源，仍需借助传统微生物培养方法。本研究运用传统微生物培养和16S r DNA 基因测序相结合的方法从夏季刚羽化的桉树枝瘿姬小蜂雌成虫体内分离细菌，研究其体内可培养细菌的种类组成，为后期探讨体内可培养细菌对桉树枝瘿姬小蜂的作用提供菌株材料，进而为利用体内细菌开发新的生物防控技术奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

试虫采自广西大学林学院教学实践基地（108°17′E，22°51′N）网棚中单株栽培的巨园桉（Eucalyptus grandis×E.tereticornis）DH201-2 植物上夏季刚羽化的桉树枝瘿姬小蜂雌成虫。

1.2 可培养细菌的分离培养

参照刘宁等[8]的方法略有改进，将20头桉树枝瘿姬小蜂雌成虫在无菌的条件下用75%的酒精和1‰HgCl2消毒后，加1 mL 无菌水研磨成菌液，按照10 倍梯度稀释法制成10-1～10-5不同浓度的菌液并均匀涂于NA 培养基平板内，每个浓度重复5次，置于28 ℃的恒温培养箱内倒置培养72 h；挑取大小、颜色、形态等不同的菌落在NA培养基平板上进行四区划线纯化培养，将纯化后的菌株接种于NA斜面培养基培养。

1.3 可培养细菌16S rDNA 基因的扩增

采用Biospin 细菌基因组DNA 提取试剂盒（杭州博日科技有限公司）分别提取各细菌基因组DNA。使用细菌通用引物：27 F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1 492 R（5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’）进行PCR 扩增。扩增体系：2 × EayTaqPCR SuperMix（+dye）（北京全式金生物技术有限公司）15 μL，ddH2O 12 μL，27 F（32 P）和1 492 R（32 P）各0.5 μL，DNA模板2 μL。反应条件：95 ℃5 min；（94 ℃30 s，56 ℃30 s，72 ℃1 min）× 35 个 循 环，72 ℃10 min，4 ℃保温。用1.0%的琼脂糖凝胶检测PCR 扩增产物，并使用胶回收试剂盒进行回收纯化后送至北京睿博兴科生物技术有限公司测序。

1.4 16S rDNA序列系统发育分析

将测序结果在EzBioCloud （http：∕∕www.ezbiocloud.net∕eztaxon）进行比对，并结合RDP Classifier在线分析，选取各菌株的同源序列，采用ClustalX程序进行匹配比对，使用MEGA 5.0 软件中的Neighbor-Joining（NJ）法bootstrap 置信度1 000 次构建系统进化树[9-10]，依此来确定各菌株的分类地位。

2 结果与分析

2.1 桉树枝瘿姬小蜂体内细菌的分离纯化

利用NA培养基分离夏季桉树枝瘿姬小蜂雌成虫体内可培养细菌，根据形态、颜色等特征共获得17株不同的细菌（表1）。

2.2 菌株16S rDNA扩增及序列分析结果

以提取的上述17 株不同的细菌基因组DNA 为模板扩增16S rDNA基因，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，16S rDNA 基因片段大小均在1 500 bp 左右（图1）。将测序得到的17 条序列在EzBioCloud（http：∕∕www.ezbiocloud.net∕eztaxon）进行同源性比对，并结合RDP 数据库Classifier 分析发现，从夏季桉树枝瘿姬小蜂体内分离的17 株细菌分属于厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes），共涉及15个属，其中3株（DH10、DH11、DH12）属于芽孢杆菌属（Bacillus），DH1 属于葡萄球 菌属（Staphylococcus），DH2属于泛菌属（Pantoea），DH3属于假单胞菌属（Pseudomonas），DH4属于类诺卡氏属（Nocardioides），DH5属于不动杆菌属（Acinetobacter），DH6属于壤球菌属（Agrococcus），DH7 属于微杆菌属（Microbacterium），DH8 属于短小杆菌属（Curto-bacterium），DH9 属于寡养单胞菌属（Stenotrophomonas），DH13属于根瘤菌属（Rhizobium），DH14 属于Dyadobacter属，DH15 属于金黄杆菌属（Chryseobacterium）， DH16 属于短状杆菌属（Brachybacterium），DH17 属于微球菌属（Micrococcus）（表2）。

表1 夏季桉树枝瘿姬小蜂体内可培养细菌的菌落特征Tab.1 Colony features of culturable bacteria from Leptocybe invasa in summer

表2 夏季桉树枝瘿姬小蜂体内可培养细菌16S rDNA 序列比对结果Tab.2 16S rDNA sequence identification results of culturable bacteria from Leptocybe invasa in summer

图1 夏季桉树枝瘿姬小蜂体内可培养细菌16S rDNA 的PCR扩增产物Fig.1 16S rDNA PCR products of culturable bacteria from Leptocybe invasa in summer

2.3 系统发育分析

图2 夏季桉树枝瘿姬小蜂体内可培养细菌16S rDNA序列的N-J系统发育树Fig.2 N-J phylogenetic tree of culturable bacteria from Leptocybe invasa in summer based on 16S rDNA sequences

对测序得到的夏季桉树枝瘿姬小蜂雌成虫体内可培养细菌的16S rDNA 序列进行系统进化分析（图2）。结果表明夏季桉树枝瘿姬小蜂体内可培养细菌可归入15 个属，分别在进化树上形成了独立的分支，其中DH2、DH3、DH5、DH9、DH13 形成以变形菌门为家族的分枝，DH2、DH3、DH5和DH9 分别属于γ-变形菌纲的Erwiniaceae 的泛菌属，假单胞菌科（Pseudomonadaceae）的假单胞菌属，莫拉氏菌科（Moraxellaceae）的不动杆菌属和黄单胞菌科（Xanthomonadaceae）的寡养单胞菌属，DH13 属于α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）的根瘤菌科（Rhizobiaceae）的根瘤菌属；DH10、DH11、DH12、DH1 形成以厚壁菌门为家族的分枝，分别属于芽孢杆菌纲（Bacilli）的芽孢杆菌科（Bacillaceae）的芽孢杆菌属，葡萄球菌科（Staphylococcaceae）的葡萄球菌属；DH6、DH7、DH8、DH4、DH17、DH16 形成以放线菌门为家族的分支，分别属于放线菌纲（Actinobacteria）的微杆菌科（Microbacteriaceae）的壤球菌属、微杆菌属、短小杆菌属，类诺卡氏科（Nocardioidaceae）的类诺卡氏菌属、微球菌科（Micrococcaceae）的微球菌属，皮杆菌科（Dermabacteraceae）的短状杆菌属；DH14、DH15 形成以拟杆菌门为家族的分支，分别属于噬纤维菌纲（Cytophagia）的噬纤维菌科（Cytophagaceae） 的Dyadobacter属，黄杆菌纲（Flavobacteriia）的黄杆菌科（Flavobacteriaceae）的金黄杆菌属。表明变形菌门和放线菌门是夏季桉树枝瘿姬小蜂体内可培养细菌的优势菌群，其中DH10、DH11、DH12为同一属，亲缘关系最近；DH6、DH7、DH8为同一科，亲缘关系次之。

3 结论与讨论

本研究采用传统微生物培养和16S r DNA基因测序相结合的方法分析了夏季桉树枝瘿姬小蜂雌成虫体内可培养细菌菌群结构组成，17 株细菌分属于芽孢杆菌属、葡萄球菌属、泛菌属、假单胞菌属、类诺卡氏属、不动杆菌属、壤球菌属、微杆菌属、短小杆菌属、寡养单胞菌属、根瘤菌属、Dyadobacter属、金黄杆菌属、短状杆菌属、微球菌属，共15个属。系统进化分析表明，5株细菌属于变形菌门，6 株细菌属于放线菌门，4 株细菌属于厚壁菌门，2株细菌属于拟杆菌门，变形菌门和放线菌门为优势菌群。已有研究表明，稻纵卷叶螟（Cnaphalocrocis medinalis）和暗黑鳃金龟（Holotrichia parallela）幼虫体内细菌的优势群同样也为变形菌门和放线菌门[9-10]。

前期利用相同的方法对同一地点同一寄主植物上采集的冬季桉树枝瘿姬小蜂雌成虫体内可培养细菌进行了分离，共获得11 株细菌，分别为芽孢杆菌属3株，微球菌属2株，葡萄球菌属、片球菌属（Pediococcus）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、微杆菌属、纤维单胞菌属（Cellulomonas）、埃希氏杆菌属（Escherichia）各1 株，厚壁菌门和放线菌门为优势菌群[11]。夏冬两季桉树枝瘿姬小蜂雌成虫体内可培养细菌的种类组成存在明显的不同，可能是由于桉树枝瘿姬小蜂的生理代谢和生命周期不同造成的。俞英豪[12]对春秋两季大青叶蝉（Cicadella viridis）肠道细菌多样性进行研究，发现其肠道优势菌群存在较大的差异。杨志波等[13]研究发现越夏期和越冬期意大利蜜蜂（Apismellifera ligustica）肠道细菌的菌群结构明显不同。

一些研究表明，葡萄球菌可对宿主的生长发育产生积极的影响，假单胞菌可提高宿主的免疫反应，不动杆菌在宿主体内可参与营养代谢过程，短状杆菌和泛菌属可增强宿主的抗性，寡养单胞菌对角蛋白有一定的降解能力，根瘤菌和假单胞菌具有水解纤维素的能力，协助宿主合成碳氮类营养物质[14-21]。本研究在桉树枝瘿姬小蜂雌成虫体内也分离到了葡萄球菌属、假单胞菌属、不动杆菌属、短状杆菌属、泛菌属、寡养单胞菌属和根瘤菌属细菌，这些细菌是否在桉树枝瘿姬小蜂的生长发育、营养代谢、抗性等方面发挥作用有待进一步研究。