生物质炭与化肥氮配施对植烟土壤微生物功能多样性的影响①

葛少华，阎海涛，陈 奇，彭桂新，于建春，杨永锋，刘国顺*

生物质炭与化肥氮配施对植烟土壤微生物功能多样性的影响①

葛少华1，阎海涛1，陈 奇1，彭桂新2，于建春2，杨永锋2，刘国顺1*

(1 河南农业大学烟草行业烟草栽培重点实验室，郑州 450002；2 河南中烟工业有限责任公司，郑州 450000)

采用盆栽试验研究了生物质炭配施不同用量化肥氮对烤烟根区土壤微生物群落功能多样性的影响。研究结果显示，添加生物质炭提高了土壤有机碳和微生物生物量碳含量；减少15% 化肥氮配施生物质炭处理(T3)显著提高了土壤过氧化氢酶活性，提升了土壤新陈代谢水平。不同处理土壤微生物的碳源利用率不同，以T3处理的AWCD(平均颜色变化率)值最高，且微生物丰富度和优势度均为较高水平。主成分和热图分析表明，不同处理微生物功能差异性和优势碳源不同，其中T3处理的微生物群落功能差异性较小，优势碳源羧酸类中包含的碳源种最多。添加生物质炭可提高烟株根冠比23.06% ~ 42.36%。因此，添加生物质炭可增强植烟土壤微生物活性，提高土壤微生物功能多样性，以减少15% 化肥氮配施生物质炭效果最好。

生物质炭；化肥氮；植烟土壤；微生物多样性

微生物是土壤生态系统的重要组成部分，其群落结构和功能随着环境条件的改变而迅速发生改变[1]。微生物群落功能多样性是表达土壤微生物群落状态与功能的重要指标之一，可以评价土壤中微生物的生态特征和土壤肥力特征[2]。长期过量施用化肥影响了土壤生态系统可利用氮素，改变了土壤微生物代谢群落功能多样性[3]。

生物质炭在农业上的应用优化了作物的根际微环境[4]，促进土壤微生物种群发展，增强土壤微生物活性，从而有效调控根际土壤肥力，促进作物生长[5-6]。Glaser等[7]对生物质炭还田后与微生物的交互作用进行研究，结果表明生物质炭还田后提高了土壤有机质含量，为微生物提供了丰富碳源。微生物群落与生物质炭和土壤生态系统相互影响[8-9]，随着生物质炭在农田中的施用，其以土壤微生物的变化来反馈生物质炭对土壤生态系统的作用[10]。韩光明等[11]研究表明，生物质炭调控土壤微环境的理化性质，影响和调控土壤微生物的生长、发育和代谢，进而改善土壤肥力。

不同施肥模式或耕作制度可显著影响土壤微生物群落功能多样性[12-13]。杨宇虹等[14]研究表明，农家肥最有利于微生物的生长，有机肥次之，复合肥效果最差。姜蓉等[15]研究表明，减少20% 化肥的施用并配施生物有机肥改善了土壤微生物区系且提高了土壤微生物代谢活性。江琳琳[16]研究表明，生物质炭能提高土壤微生物丰度和多样性，提高土壤微生物碳源的代谢特征。Warnock等[17]研究表明，生物质炭的多孔性和表面特性能够为微生物生存提供附着位点和较大空间。陈伟等[12]研究表明，生物质炭对土壤微生物多样性的改善效果则不如生物有机肥。

目前对微生物功能多样性影响的报道中，关于生物质炭施用条件下配施化肥氮对烤烟根区土壤微生物群落多样性的变化尚不清晰。本研究采用盆栽方式，研究添加生物质炭后不同氮肥用量对土壤微生物功能多样性指标的影响，旨在为制订合理的烤烟施肥措施提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2017年在河南农业大学许昌校区现代烟草农业科教园区开展，供试品种为K326。供试土类为褐土，土壤基础肥力见表1。

表1 供试土壤基础肥力

所施用生物质炭为花生壳炭(图1)，由河南省生物炭工程技术研究中心提供，其理化性质为：pH 8.25，全碳3.99 g/kg，全氮0.169 g/kg，碳氮比23.62，主要官能团为羟基、烷烃和酰胺基等。

图1 花生壳炭电镜微观表面扫描图(放大500倍)

1.2 试验设计

采用盆栽试验，设置4个处理：T1(CK)，纯氮(N)5 g/盆；T2，纯氮5 g/盆+生物质炭100 g/盆；T3，纯氮4.25 g/盆(减氮15%)+生物质炭100 g/盆；T4：纯氮3.5 g/盆(减氮30%)+生物质炭100 g/盆。

所用氮素为烟草专用复合肥(N∶P2O5∶K2O = 10∶10∶20)，试验设置N∶P2O5∶K2O=1∶1.5∶3，不足的磷钾肥用过磷酸钙和硫酸钾补足。全部生物质炭和70% 的混合肥料与每盆土混匀，30% 的混合肥料于移栽后30 d施入盆内。本试验2017年5月8日移栽烤烟，栽培管理措施按照当地常规管理方法进行。

1.3 样品采集与测定方法

土壤样品于烤烟旺长期收集根上抖落的附着土壤进行分批保存。一部分鲜土过筛后于4℃冰箱保存，用于测定硝态氮(NO3–-N)、铵态氮(NH4+-N)、微生物生物量碳(MBC)、微生物生物量氮(MBN)和微生物功能多样性；一部分土样风干过筛后用于测定pH、有机碳和过氧化氢酶活性。硝态氮和铵态氮采用连续流动分析仪测定，微生物生物量碳采用熏蒸浸提-重铬酸钾容量法测定，土壤微生物生物量氮采用熏蒸浸提法测定[17]，pH(水土比2.5︰1)采用电位计法测定，有机碳采用重铬酸钾外加热法测定[18]，过氧化氢酶活性采用高锰酸钾滴定法测定[19]。微生物功能多样性的检测采用有31种碳源的BiologEcoplatesTM进行培养试验，25℃恒温培养，在24、48、72、96、120和144 h时测定各孔在590 nm波长下的光吸收值[14]。

烟株取样后进行杀青，粉碎，过筛，烟叶总氮测定依据烟草行业标准，采用连续流动分析仪进行测定。

1.4 数据处理与分析

土壤微生物利用碳源的整体能力，用平均颜色变化率(AWCD)表示[20-21]，计算方法如下：

式中：C为每个培养基孔的吸光值；为对照孔的吸光值；31表示本研究中有31种碳源。当(C-)<0时，赋其值为0。

根据各处理AWCD值变化，本研究选取120 h 时各孔吸光值计算微生物功能多样性指数。

Simpson指数()：

Shannon指数(：

Mcintosh指数()：

在智慧园区总体构想中，其中还有很多缺陷和不足有待完善。当前我国已经有大量不同类型园区，智慧园区经过长期建设和完善，园区信息化和智能化水平不断提升，但是在此期间必将出现原有园区和新建园区信息化系统对接问题，直接影响到智慧园区建设成效[2]。其二，园区建设积累了丰富的经验，内部包含二级单位，这些地块开发商由于资质不同，个性化需求同样有所不同，所以智慧园区总体构想需要予以综合考量。结合智慧园区总体构想，建立支撑平台层，实现对系统的统一管理，完善配套接口。此外，当前的智慧园区总体架构中，与信息技术发展趋势尚未完全融合。

Shannon均匀度指数(E)：

=/ln(5)

本研究采用Excel 2013进行数据前期整理，SPSS 20.0和R语言进行分析。

2 结果与分析

2.1 生物质炭与化肥氮配施对烤烟根区土壤化学和生物学特性的影响

添加生物质炭对土壤pH具有显著影响，以T1处理为对照，各处理pH分别下降0.10、0.24和0.34。生物质炭的添加在一定程度上提高了土壤有机碳含量，T4处理较其他处理具有显著性差异，且有机碳含量随着化肥氮施用量减少而提高，为T4>T3>T2> T1，T2、T3、T4处理较T1处理分别提高了12.28%、20.57%和37.75%。添加生物质炭降低了烤烟根区土硝态氮的含量，T1>T2>T3>T4，随着化肥氮施用量的减少，硝态氮含量显著降低。土壤微生物生物量氮含量T2处理较T1处理降低了29.96%，T3处理较T2处理提高了15.79%，而T4处理与T2处理则无显著性差异；微生物生物量碳含量T2处理较T1处理降低了9.08%，在添加生物质炭的基础上，随着化肥氮施用的减少，显著提高了微生物生物量碳含量。过氧化氢酶活性是土壤新陈代谢水平的重要表征，T1、T2和T4处理无显著性差异，T3处理较T1处理过氧化氢酶活性提高了14.23%。施用生物质炭后有效降低了微生物熵，T2处理下降了19.37%，化肥氮用量的减少对微生物熵的影响不显著。

表2 不同处理对烤烟根区土壤化学和生物学特性的影响

注：同列不同小写字母表示不同处理间差异显著(<0.05)，下同。

2.2 生物质炭与化肥氮配施对烤烟根区土壤微生物AWCD值的影响

AWCD值反映了微生物群落对碳源利用的总能力，其值越大，表明土壤微生物活性越高，密度越大[20, 29]。由图2可知，烟草根区土壤微生物对不同碳源的利用程度均随培养时间的增加而增大。在0 ~ 24 h内变化较小且接近0，在48 h之后碳源被迅速利用，AWCD值急剧增加。在整个监测期，T3处理AWCD值一直保持较高水平，而T4处理维持最低水平，表明过量减少化肥氮，减少了微生物能源物质，降低了微生物活性。

图2 不同处理对植烟土壤微生物AWCD值的影响

2.3 生物质炭与化肥氮配施对烤烟根区土壤微生物功能多样性指数的影响

选择培养120 h时的AWCD值来计算土壤微生物功能多样性指数。Shannon指数()是反映群落物种及其个体数和分布均匀程度的综合指标，受群落物种丰富度影响较大。Simpson指数()较多反映了群落中最常见的物种优势度。Mcintosh指数()是群落物种均一性的度量。反映了Shannon指数的均匀度。为碳源利用丰富度指数。由表3可知，各处理物种丰富度和优势度均为T3>T2>T1>T4，但T1、T2和T3处理无显著差异，T4处理显著低于各处理，较T1处理分别降低了3.73% 和0.37%。Mcintosh()指数为T3>T1>T2>T4，表明添加生物质炭降低了微生物物种的均一度，而在添加生物质炭的基础上，适量减少化肥氮用量，有效提高了均一度值。均匀度()与Shannon指数表现规律相反，为T4>T1>T2>T3，T4处理较T1处理提高了2.80%，较T3处理提高了4.58%。丰富度指数为T3>T2>T1>T4，表明添加生物质炭提高了物种丰富度指数，适宜减少化肥氮的施用，更有利于丰富度指数的提高。

2.4 生物质炭与化肥氮配施对烤烟根区土壤微生物碳源利用特征的影响

由图3主成分分析可知，T1处理分布在第一和第三象限，T2处理分布在第四象限，T3处理分布在第一象限，T4处理分布在第二象限。在主成分分析中，PC1的方差贡献率为40.63%，PC2的方差贡献率为20.79%，累积达到61.42%。T1处理在PC轴上出现较大分异，表现出微生物群落的不稳定性。不同施氮量对微生物群落功能多样性的影响在空间距离差异上分布较明显，表明肥料用量导致微生物群落代谢功能改变。T1和T2处理出现在不同象限，表明添加生物质炭对微生物功能多样性也有一定的影响。T3和T1处理在第一象限内的空间分布距离较短，说明二者在微生物群落功能多样性方面差异较小。

表3 不同处理对烤烟根区土壤微生物功能多样性指数的影响

图3 不同处理土壤微生物碳源利用特征的主成分分析

不同处理下，烤烟根区土壤微生物对不同类别碳源的利用程度存在显著差异(图4)。土微生物群落对碳水化合物、氨基酸、羧酸和多聚物4类碳源的利用强度均为T3>T1>T2>T4；酚酸类为T3>T1>T4>T2，T2和T4无显著性差异；胺类为T2>T3>T1>T4。T1处理各类碳源利用所占比例为13.24% ~ 19.39%，较为均匀，其中以氨基酸类最高，酚酸类最低；T2处理各类碳源利用占比为7.93% ~ 20.04%，以胺类最高，酚酸类最低；T3处理中各类碳源(碳水化合物、氨基酸、羧酸、多聚物、酚酸和胺类)利用占比分别为17.39%、17.37%、20.57%、16.24%、14.12% 和14.3%，以羧酸类最高，酚酸类最低；T4处理各类碳源利用占比为11.35% ~ 22.15%，以碳水化合物类最高，酚酸类最低。表明根区土壤微生物群落对酚酸类利用最少，不同的施肥条件可显著影响土壤微生物群落对不同碳源的利用强度。

图4 不同处理土壤微生物群落对6类碳源的利用强度

对6类共31种碳源进行分析(图5)，各处理对碳水化合物(D-纤维二糖、α-D-葡萄糖-1-磷酸)、羧酸(衣康酸、D-苹果酸、丙酮酸甲酯)、多聚物(α-环式糊精、吐温80)、胺类(腐胺)，无显著性影响。T1、T2和T3处理对碳水化合物(D-半乳糖酸-γ-内脂、i-赤藓糖醇、D-木糖)、氨基酸(L-天门冬酰胺、L-精氨酸)、多聚物(吐温40)，无显著性影响，T4处理显著低于其他处理。对各处理优势碳源中的具体碳源种进行分析发现，T1处理的土壤微生物对氨基酸类的L-苏氨酸和甘氨酰-L-谷氨酸的碳源利用强度较大，且明显高于其他处理；T2处理土壤微生物对胺类中苯乙胺的利用显著高于其他处理；羧酸类的γ-羟基丁酸、D-苹果酸、丙酮酸甲酯、D-半乳糖醛酸和D-葡萄糖胺酸在T3处理中的利用显著高于其他处理。T4处理微生物对碳水化合物类的β-甲基-D-葡萄糖苷和N-乙酰-D-葡萄糖胺的利用强度大，显著高于其他处理。土壤微生物对酚酸类利用强度较小，主要是因2-羟基苯甲酸含量较低。

图5 不同处理土壤微生物群落对31种碳源的利用强度

2.5 生物质炭与化肥氮配施对烤烟生长的影响

图6A显示不同处理烤烟干物质积累T3>T1> T2>T4，T1和T3处理无显著性差异，各处理较T1处理分别下降了6.16%、–0.7% 和18.21%。烟株根冠比为T3>T4>T2>T1，表明添加生物质炭有利于烟株根系的生长。图6B显示烤烟旺长期地上部氮素积累量T1>T2>T3>T4，生物质炭对烟株旺长期氮素积累有一定的降低作用，且随着施肥量的减少，氮素积累量降低。T1较各处理氮素积累量提高14.7、17.55和25.8 kg/hm2。

3 讨论

3.1 生物质炭与化肥氮配施对烤烟根区土壤特性和烤烟生长的影响

生物质炭施入后由于其对土壤生物和化学特性的影响，在不同程度上调控作物生长，最终可提高作物产量和品质[4]。大量研究表明[22-23]，添加生物质炭提高了土壤pH，但本文研究结果显示，添加生物质炭降低了土壤pH，且随着化肥氮用量的减少，土壤pH随之降低。这可能是根区土壤中根系分泌物含量增加[24]，也可能是微生物群落对酚酸类利用程度较低，造成其在土壤中的积累，引起土壤pH下降[16]，同时铵态氮的硝化作用也可引起土壤酸化。添加生物质炭提高了土壤有机碳含量，这与胡玮等[25]关于不同碳氮比对小麦的影响研究结果和沈盟等[26]关于生物质炭施用提高番茄土壤有机碳含量结论一致。微生物熵随着生物质炭的添加呈现下降趋势，而陈红丽[27]研究表明微生物熵与微生物生物量碳变化趋势一致，可能是秸秆的碳释放率显著高于生物质炭。本研究结果表明，生物质炭的添加和化肥氮用量的减少对过氧化氢酶活性影响较小，添加生物质炭在一定程度上能减轻过氧化氢的毒害作用，但对过氧化氢酶的活性无显著性影响[28]，这与张继旭等[29]研究结果一致；但黄哲等[30]及陈心想等[31]研究表明，生物质炭的添加对过氧化氢酶活性有促进作用，这可能与研究所用的生物质炭种类、作物种类以及土壤类型有关。添加生物质炭后，有效提高了土壤肥力，促进植株根系生长，本研究结果表明，添加生物质炭有效提高了烟株根冠比。由于生物质炭的吸附作用，降低了土壤中氮素含量，影响了烤烟对氮素的吸收积累。

图6 不同处理对烤烟生长的影响

3.2 生物质炭与化肥氮配施对根区土壤微生物群落功能多样性的影响

添加生物质炭后，微生物的利用基质发生改变[32]，不同的农业措施对土壤微生物群落碳源利用能力产生不同的影响。本研究中，随着培养时间的延长，添加生物质炭降低了土壤微生物AWCD值，添加生物质炭+减少15% 化肥氮处理对土壤微生物利用碳源能力的影响优于其他处理。这可能是因为土壤微生物生态对氮肥的施入量存在一定的平衡，过多或过少施用化肥氮，都有可能降低土壤微生物群落活性[15]；也可能是因为施肥习惯的改变，影响了土壤酶活性和微生物生物量的变化，改变了土壤微生物的多样性及活性[33]。

微生物功能多样性指数分析结果表明，不同处理对土壤微生物群落功能多样性的影响有显著差异，微生物种群的数量、优势物种的优势度，以及各个物种的均一度各不相同。物种均一度和丰富指数方面一直保持T3处理最高，T4处理最低，可能是化肥氮的过量减少，导致土壤中氮素含量下降，促进了某些微生物种群生长代谢，抑制了其他微生物种群的生长代谢，进而影响微生物群落功能多样性指数[12]。

不同处理下，土壤微生物群落对碳源的利用情况不同，且对6类31种碳源的利用存在显著差异。施用化肥氮相同的情况下，添加生物质炭促进了土壤微生物群落对胺类的利用，而抑制了对其他5类碳源的利用；化肥氮的减少会抑制微生物对胺类的利用；除胺类外，其他5类碳源均表现为T3处理利用强度最高，可能是根系分泌物数量较多，导致进入土壤的新鲜有机质增加，刺激了土壤微生物的生长和繁殖，提高了代谢活性[34]。

长期过量施用化肥，导致土壤微生物生物量降低、生物种群和功能多样性衰减、土壤的生物化学过程强度减弱、有机碳转化和养分供应能力下降[16]。添加生物质炭减少化肥氮的施用，使土壤铵态氮、硝态氮等养分分配发生了变化，进而影响微生物群落活性、代谢方式和功能多样性，而微生物不同的群落结构和功能又会影响土壤中各种养分的循环转化过程，影响土壤养分的含量及形态[35-36]。由于土壤微生物群落的数量及结构的变化直接影响根际微生物整体功能，在植物根系生长的微生态环境中微生物群落对烟株根系的影响有待进一步研究。

4 结论

本研究表明，添加生物质炭减少化肥氮的施用，在一定程度上影响了土壤的化学和生物学特性。添加生物质炭减少15% 化肥氮时，可有效提高土壤新陈代谢水平，显著提高土壤微生物碳源利用能力，提高烟株根冠比，在微生物群落的稳定性方面，较为接近常规化学施肥，对土壤微生物功能多样性影响较小。因此，添加生物质炭并减少15% 化肥氮时，改善了烟株根区土壤肥力，增强了土壤微生物活性，促进了微生物种群的发展。

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Effects of Biochar Combing with Nitrogen Fertilizer on Functional Diversity of Microbial Communities in Tobacco-planting Soil

GE Shaohua1, YAN Haitao1, CHEN Qi1, PENG Guixin2, YU Jianchun2, YANG Yongfeng2, LIU Guoshun1*

(1 National Tobacco Physiology & Biochemistry Research Centre, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2 China Tobacco Henan Industrial Co. Ltd., Zhengzhou 450000, China)

A pot experiment was conducted to study the effects of biochar combined with different dosages of nitrogen fertilizer on the functional diversity of soil microbial community in flue-cured tobacco rhizosphere. The results showed that biochar application increased the contents of soil organic carbon and microbial biomass carbon, and the treatment of biochar with 15% reduction of nitrogen fertilizer (T3) significantly improved soil catalase activity and metabolism level. Carbon source utilization of soil microorganism were different under different treatments, T3 treatment had the highest average well color development (AWCD) value, and smaller soil microbial richness and dominance. Principle component analysis and thermal graph analysis showed that the functional differences and dominant carbon sources of soil microbial communities were different under different treatments, among of which, T3 treatment had smaller functional difference and contained most carbon sources in the dominant carbon source carboxylic acids. The biochar application improved root-crown ratio of tobacco by 23.06%–42.36%. Therefore, biocar application can enhance the microbial activity of tobacco-planting soil and improve the diversity of soil microbial function, and the biochar combing with 15% reduction of nitrogen fertilizer has the best effect.

Biochar; Nitrogen fertilizer; Tobacco-planting soil; Microbial diversity

10.13758/j.cnki.tr.2019.04.011

烟草栽培重点实验室项目(110201101001TS-1)和河南中烟工业有限责任公司项目(ZW2014005)资助。

(Liugsh1851@163.com)

葛少华(1992—)，女，河南周口人，硕士研究生，主要从事烟草栽培生理研究。Email: ycgsh@outlook.com

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