吴李碘泡虫的重描述及其长江流域不同江段株系的比较研究

杨承忠 张雕雕 赵元莙

(重庆师范大学生命科学学院, 重庆市动物生物学重点实验室, 重庆 401331)

吴李碘泡虫Myxobolus wulii(Wu & Li) Landsberg & Lom, 1991, 隶属于黏体门Myxozoa, 双壳目Bivalvulida, 碘泡科Myxobolidae, 最初由Wu & Li于1986年在我国鲫Carassius auratus auratusLinnaeus的鳃丝中检获并命名为大型黏体虫Myxosoma magnaWu & Li, 1986。随后又在白鲢Hypophthalmichthys molitrixValenciennes、青Leiocassis brashnikowiBerg、马口鱼Opsariichthys bidensGünther陆续发现有该寄生虫的寄生[1,2]。然而, 早在1984年, 就有学者建议将黏体虫属MyxosomaThélohan, 1892的所有种合并至碘泡虫属MyxobolusBütschli, 1882中, 并修正其属名为碘泡虫属Myxobolus[3], 该观点被学界广为接受[4]。按照国际动物命名法规, 大型黏体虫Myxosoma magna修正后学名应为大型碘泡虫。由于该学名已有物种Myxobolus magnusAwerinzew, 1913占用, 因此, Landsberg & Lom将其重新命名为吴李碘泡虫Myxobolus wuliiLandsberg & Lom, 1991。先前的研究一直认为吴李碘泡虫M. wulii、寄生于异育银鲫C. auratusgibelioBloch肝胰脏的关桥碘泡虫M. guanqiaoensisWu & Wang, 1997[5]以及寄生于日本金鱼鳃丝的碘泡虫未定种M.sp. Yokoyama,et al. 1992[6]是3个不同的种。继后, Zhang等[7]综合形态和分子数据,指出这三者实际上均为吴李碘泡虫M. wulii。吴李碘泡虫长江中游(湖北段)和下游(江苏段)株系(含有分子数据的)均有过报道[7—9], 而近期我们又在长江流域重庆段获得了长江上游株的数据, 同时这3个地理株系(下文统一分别称为： 吴李碘泡虫重庆株、湖北株和江苏株)中又有宿主类型和寄生部位等的差异。基于此, 我们在对吴李碘泡虫进行重描述的基础上进一步对这三大地理株系进行了比较研究, 以期更深入的了解吴李碘泡虫这一鱼类重要寄生虫的种群演化规律。

1 材料与方法

1.1 标本的采集与物种的鉴定

宿主鲫C. auratus auratus样本分别于2017 年11 月和2018年4月采自长江流域重庆段, 感染率分别为25% (8尾中2尾感染)和10% (10尾中有1尾被感染)。在被感染的宿主鱼鳃部可以观察到吴李碘泡虫孢囊, 该寄生虫标本的检获及处理参考文献[10]完成。

1.2 DNA 提取与 PCR 扩增

DNA 提取将获得的吴李碘泡虫孢囊立即镜检, 显微拍照, 再用溶质体积分数为95%的乙醇溶液保存于离心管中, 首先从装有实验材料的离心管底部吸取10 μL获得的黏孢子虫液体, 经超纯水清洗2—3次以除去杂质, 再进行基因组DNA的提取。DNA抽提采用Dneasy Tissue Kit (QIAGEN,Germany)试剂盒, 操作方法按照厂家提供的说明书步骤进行。提取完成的基因组DNA置于-20℃冰箱保存备用。

PCR 扩增用于扩增18S rDNA基因的引物分别为ERIB1(5′-ACCTGGTTGATCCTGCCAG-3′)和ERIB10 (5′-CTTCCGCAGGTTCACCTACGG-3′)[11], 当第一轮未扩增到目的片段时, 换用引物18E(5′-CTGGTTGATCCTGCCAGT-3′)[12]和18R (5′-CTACGGAAACCT TGTTACG-3′)[13]。PCR反应体系如下： 10×ExTaqbuffer (Mg2+free) 2.5 μL, 25 mmol/L的MgCl22.5 μL, 25 mmol/L的dNTP 2.5 μL, 10 μmol/L的引物各0.5 μL, 1.2 ng的模板DNA, 5 U/μL的ExTaq酶0.2 μL, 最后用灭菌超纯水补足至终体积25 μL。PCR反应条件为： 95℃预变性5min; 95 ℃变性50s,58℃退火1min, 72℃延伸2min, 35个循环; 最后72℃延伸10min。取3 μL PCR产物在琼脂糖凝胶电泳中检测, 然后将有目的条带的PCR产物用胶回收试剂盒Gel Extraction Kit (OMEGA, America)纯化回收并送上海英骏生物技术有限公司测序(ABI,3730XL测序仪)。

1.3 序列分析和系统发育

序列的选取将本研究获得的2条吴李碘泡虫18S rDNA序列分别在GenBank中通过BLAST进行序列同源性比对。根据比对结果, 选取同源性较高的29条碘泡虫序列, 包括本研究得到的2条吴李碘泡虫序列。另外选取Tetracapsuloides bryosalmonae(KF731712)和Buddenbrockia plumatellae(AY074915)作为外群构建系统发育树。

18S rDNA 序列分析通过Clustal W程序按照缺省参数进行序列多重比对, 序列相似度的计算用在线序列双重比对工具(http：//www.ebi.ac.uk/Tools/psa/)计算获得。所选序列进行两两之间的遗传距离利用MEGA 6.0[14], 选择K2P模型计算完成。

系统树的构建利用在线软件The CIPRES Science Gateway V. 3.1 (http：//www.phylo.org/sub_sections/portal/)构建Maximum-likelihood (ML)树,选用模式为RAxML-HPC2 XSEDE (8.2.10)[15—17],Bayes (BI)树在MrBayes 3.1.2软件[18]中构建, 位点变异设置为invgamma分布, 序列最佳进化模型为GTR+I+G, 运行1000000代。最后用FigTree v1.4.2和Photoshop CS3完成系统树的绘制。

2 结果

2.1 吴李碘泡虫重庆株系形态学重描述

吴李碘泡虫重庆株系, 其成熟孢子壳面观为长卵形, 缝面观呈梭形, 前端稍尖后端钝圆, 孢子表面光滑, 2个极囊等大、长梨形, 并列呈“八”字形于孢子前端, 极囊约占孢子体积的1/2, 极丝清晰可见约7—9圈。孢子量度(n=40)为： 孢子长(14.45±0.70) μm(13.06—15.93 μm), 孢子宽(9.87±0.87) μm (8.07—11.17 μm); 极囊长(7.67±0.63) μm (6.54—8.31 μm),极囊宽(3.90±0.22) μm (3.49—4.27 μm) (图 1、表 1)。宿主鱼未发现明显病症。

2.2 吴李碘泡虫 18S rDNA 分子特征

测得吴李碘泡虫重庆株系的2条18S rDNA序列长度分别为1921和1912 nt, 将序列提交至Gen-Bank, 登录号分别为MH920541和MH920542。吴李碘泡虫的18S rDNA经BLAST比对的结果显示,在可比范围内, 本研究得到的吴李碘泡虫重庆株系与湖北株系(序列登录号为KJ725081和EF690300)和江苏株系(序列登录号为HQ613412)相似度在99%以上(99.2%—99.9%, 表 2)。

遗传距离分析结果显示, 本研究获得的吴李碘泡虫重庆株系两序列(MH920541和MH920542)之间的遗传距离为0.001, 重庆株系分别与湖北株系(KJ725081和EF690300)、江苏株系(HQ613412)的遗传距离均为0.007; 湖北株系两序列(KJ725081和EF690300)之间的遗传距离为0.001; 湖北株系与江苏株系的遗传距离均为0.002 (表 2)。

2.3 系统发育

基于18S rDNA构建的ML和BI树呈现出一致的拓扑结构(本文只呈现BI树, 图 2)。所有碘泡虫物种分为2大支系(A支和B支)。在B支系中, 所有吴李碘泡虫聚成一支, 该支系与瓶囊碘泡虫和洪湖碘泡虫构成的进化枝形成姐妹群关系。在吴李碘泡虫支中, 重庆株系聚成一支最先分化, 湖北和江苏株系聚成另外一支后分化。其中, 吴李碘泡虫湖北株系和江苏株系并未形成地理种群特有的进化枝,而是相互交叉成枝(图 2)。

3 讨论

本研究获得的吴李碘泡虫重庆株系孢子及极囊均比湖北株系略小, 湖北株系两个极囊在大小上略有差异, 而重庆株系两个极囊等大(表 1)。江苏株系由于无形态学数据, 无法比较。以往诸多基于18S rDNA为分子标记的黏孢子虫物种鉴定方面的研究表明, 绝大多数黏孢子虫的种内相似度范围为98.6%—100%, 而种内遗传距离范围大多数集中在0.000到0.007[19—22]。本研究吴李碘泡虫三大地理株系序列相似度(99.2%—99.9%)和遗传距离(0.002—0.007)分析的结果显示三大地理株系均为同一物种。因此, 尽管各地理株系在形态量度上存在一定差异, 但从分子水平上看, 均在种内水平的形态变异。而这些差异可能与地理环境、宿主种类及感染部位有关。

图 1 吴李碘泡虫重庆株系孢子形态图Fig. 1 Morphology of M. wulii from Chongqing strain

表 1 长江流域吴李碘泡虫M. wulii不同株系的形态学比较Tab. 1 Morphological comparison of different strains of M. wulii in the Yangtze River Basin

一般而言, 对于自由生活的动物, 地理隔离在种群分化中起着重要作用, 而长距离的地理隔离是导致自然种群分化的重要因素。从遗传距离及相似度来看, 三大地理株系之间的遗传变异并不能反映地理隔离与种群分化之间的必然联系(表 2、图 2)。以往的研究表明, 对于寄生生活的寄生虫种群变异受宿主种类的影响强于受地理隔离的影响[23—26]。然而, 系统发育分析并未显示所有寄生于鲫的吴李碘泡虫之间具有更近的亲缘关系, 如宿主为鲫的江苏株系(HQ613412)却与宿主为异育银鲫的湖北株系1(EF690300)聚为一支(图 2)。也有研究表明寄生虫积极地转移栖息地时, 通过寄生部位的选择也会导致物种种群分化甚至形成新种[23]。本研究鳃寄生与肝胰脏寄生的吴李碘泡虫分别聚为两大支系, 且鳃寄生支系先分化出来(图 2)。这表明, 相同寄生部位的吴李碘泡虫具有更近的亲缘关系, 且鳃寄生的吴李碘泡虫株系相对原始。这可能与体表寄生和体内寄生的演化有关： 与体内寄生相比, 寄生于鳃所需克服的宿主保护屏障较少。而在宿主身体内部寄生, 不仅要克服更多的保护屏障,还会受到宿主免疫反应等的排斥作用。因此, 鳃寄生的吴李碘泡虫可能是较早定居的群体, 随着其不断进化, 侵入宿主的能力加强, 逐渐分化出在肝胰脏寄居的吴李碘泡虫群体。由于18S rDNA序列的保守性, 所含信息可能不足以完全说明吴李碘泡虫三大株系之间的自然演化规律。因此, 增加ITS-1 rDNA等高变异分子标记及增加样本量应是今后研究吴李碘泡虫种群分化规律优先开展的工作。虽然18S rDNA序列较为保守, 但本研究显示吴李碘泡虫不同江段株系序列间已有变异, 这表明吴李碘泡虫已出现一定程度的分化, 形成了不同的种群。

表 2 四种相似碘泡虫基于18S rDNA序列的相似度与遗传距离Tab. 2 Similarities and genetic distances of four similar Myxobolus species (12 sequences) based on 18S rDNA sequences

图 2 基于18S rDNA序列构建的BI系统进化树Fig. 2 Phylogenetic tree generated by BI based on the 18S rDNA gene sequences