c(RGDfC)-PEG-PCL靶向纳米载体的合成及其条件优化

张 旭,葛 飞,朱龙宝,李婉珍,宋 平,陶玉贵

(安徽工程大学 生物与化学工程学院，安徽 芜湖 241000)

化学治疗(化疗)是临床治疗恶性肿瘤的主要方法之一[1]，但化疗药物的生物利用度低、选择性差，药物进入体内后，迅速分散到体内的各组织、器官中，只有少部分化疗药物能够随机到达肿瘤部位，导致化疗药物对肿瘤细胞和正常组织、器官都会造成杀伤[2-3]。如何使化疗药物精确递送至肿瘤部位成为肿瘤治疗的研究热点。纳米科学技术在材料合成、生物和药学领域的广泛应用，为靶向递送化疗药物提供了机遇[4]。其中纳米载体由于具有靶向递送、可控释放、较低的生物毒性和更高的药物生物利用度等特点，已经成为化疗药物递送的热门研究领域[5-6]。

纳米材料聚己内酯(PCL)以其优良的生物降解性及生物相容性，近年来被广泛应用到药物载体领域，并获得美国FDA的批准[7]。聚己内酯由几内酯开环聚合得到，具有很好的柔韧性和可加工性，其熔点为59～64℃，这为其应用于药物可控释放提供了依据。但表面具有疏水性的PCL在体内容易被蛋白质吸附和网状内皮细胞识别并捕获，这导致其在体内的循环时间减少[8]。为了满足聚己内酯作为药物载体的应用需求，通常在其表面进行亲水性修饰。聚乙二醇(PEG)是一种生物相容性好、毒性低的水溶性聚合物[9]，PEG与PCL进行共聚，形成PEG-PCL共聚物，有效地提高了其在体内的循环时间。但PEG-PCL载体在体内无法主动靶向肿瘤细胞，仅仅依靠高通透性和滞留效应(EPR)无法在肿瘤部位大量积累，使得治疗效果降低[10]。因此，对PEG-PCL表面进行靶向性修饰非常必要。RGD肽是一类含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列且广泛存在于体内的短肽，它可以与肿瘤部位特异性表达的αvβ3、αvβ5等整合素特异性结合，从而达到主动靶向肿瘤部位的目的[11]。

研究合成了具有主动靶向性的纳米载体c(RGDfC)-PEG-PCL，并优化了c(RGDfC)-PEG-PCL的合成条件，探索了c(RGDfC)-PEG-PCL的最佳合成条件。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

N-芴甲氧羰基-L-天冬氨酸-1-叔丁酯(Fmoc-Asp-otbu)、N-芴甲氧羰酰基-2,2,4,6,7-1五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰-L-精氨酸(Fmoc-Arg(pbf)-OH)、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸(Fmoc-Cys(trt)-OH)、N-芴甲氧羰基-D-苯丙氨酸(Fmoc-D-Phe-OH)、N-芴甲氧羰基-L-甘氨酸(Fmoc-Gly-OH)以及2-氯树酯(负载量0.98 mmol·g-1，购于合肥国肽生物科技有限公司)；N，N-二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-羟基苯并三唑(HOBt)、 (3H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基六氟磷酸盐(PyAOP)、N-乙基二异丙胺(DIEA)、二氯甲烷(DCM)、N,N-二甲基甲酰胺 (DMF)以及三氟乙酸(TFA)、茚三酮等试剂均为分析纯，甲醇、乙腈为色谱纯(购于阿拉丁试剂上海有限公司)；马来酰亚氨基-聚乙二醇-聚己内酯(Mal-PEG113- PCL55，购于上海芃硕生物科技有限公司)。

Bruker AVANCE Ⅲ 600M型核磁共振谱仪(以TMS为内标，2% D2O与98% H2O为溶剂，德国Bruker公司)；LC-20A 高效液相色谱仪、Shim-pack VP-ODS C18液相色谱柱、ESI-MS-8030三重四极杆质谱仪(日本岛津公司);RE-52型旋转蒸发仪(上海青浦沪西仪器厂)；DFY-5/25 低温恒温反应浴仪(常州诺基仪器有限公司)；2XZ型旋片式真空泵(上海双鹅制冷设备有限公司)、SHB-IV循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)。

1.2 c(RGDfC)-PEG-PCL的合成

(1)利用固相合成法合成直链肽RGDfC。在砂芯反应器中合成得到含有直链五肽RGDfC的树脂，用全保护切割法将多肽与树酯分离，冷冻干燥后得到粗品直链肽RGDfC，粗品用半制备型高效液相色谱进行纯化，得到高纯度的直链肽RGDfC。

(2)用液相环合法合成环肽c(RGDfC)。取纯化后的直链肽RGDfC溶于无水二氯甲烷中，加入PyAOP、HOAT和DIEA作为缩合剂，0 ℃下过夜反应；得到的环肽用TFA切割法除去氨基酸侧链的保护基，得到粗品环肽c(RGDfC)；粗品环肽c(RGDfC)用高效液相色谱进行纯化得到高纯度的环肽。

(3)c(RGDfC)-PEG-PCL的合成。称取50.0 mg靶向环肽c(RGDfC)和10.0 mg马来酰亚氨基-聚乙二醇-聚己内酯(Mal- PEG113-PCL55)于干净的烧杯中，加入10 mL的DMF，并用玻璃棒搅拌直至固体完全溶解，调节pH值在7.5～8.0之间，加入DIEA作为催化剂，搅拌反应24 h。

1.3 c(RGDfC)-PEG-PCL靶向纳米载体的表征

(1)质谱分析。利用ESI-MS对合成的靶向环肽进行分析。取少量c(RGDfC)样品，以甲醇为溶剂进行稀释溶解，甲醇为测试所用的流动相，测试模式为正离子模式。

(2)核磁表征。利用核磁共振谱仪(以TMS为内标，2% D2O与98% H2O为溶剂)对c(RGDfC)-PEG-PCL进行核磁表征，并对特征峰进行归属。

(3)c(RGDfC)-PEG-PCL的合成率分析。反应过程中游离的靶向环肽含量会随着反应的进行而减少，所以可以通过测定反应前后靶向环肽的量，从而计算出产物的合成率。采用高效液相色谱仪对反应前后的溶液进行分析，根据c(RGDfC)在高效液相色谱中的出峰面积来计算合成率，计算公式如下：

式中，S0为c(RGDfC)的初始峰面积；S为反应后c(RGDfC)的峰面积。

1.4 c(RGDfC)-PEG-PCL靶向纳米载体的合成优化

靶向环肽c(RGDfC)与纳米载体Mal-PEG-PCL合成的本质是迈克尔加成反应，根据其反应特点，从反应时间、pH值、温度、催化剂以及溶剂这5个方面研究c(RGDfC)-PEG-PCL合成的最佳反应条件。

(1)反应时间对c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影响。固定pH值为7.5、温度为25 ℃，用DIEA作为催化剂、DMF作为溶剂，考察反应时间对c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影响，反应时间设定为4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h和28 h。

(2)pH值对c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影响。固定反应时间为24 h、温度为25 ℃，用DIEA作为催化剂、DMF作为溶剂，考察pH值对c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影响，pH值设定为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和10.0。

(3)温度对c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影响。固定反应时间为24 h、pH值为7.5，用DIEA作为催化剂、DMF作为溶剂，考察温度对c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影响，温度设定为20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃和50 ℃。

(4)催化剂对c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影响。固定反应时间为24 h、pH值为7.5、温度为25 ℃，用DMF作溶剂，考察加入催化剂对c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影响，设定为无催化剂组和加入催化剂DIEA组。

(5)溶剂对c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影响。固定反应时间为24 h、pH值为7.5、温度为25 ℃，用DIEA作为催化剂，考察溶剂对c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影响，溶剂设定为甲醇、二甲基亚砜、DMF和DCM。

2 结果与讨论

2.1 质谱分析

靶向环肽c(RGDfC)的质谱图(ESI-MS)如图1所示。c(RGDfC)的理论分子量为578.25，质谱中主要的电荷峰只有一个，其电荷为579.25(M+H)H+，与理论分子量一致，说明合成的多肽确为目标产物c(RGDfC)。

图1 c(RGDfC)的ESI-MS谱图

2.2 核磁表征

靶向纳米载体c(RGDfC)-PEG-PCL的氢谱图(1H-NMR)如图2所示。对氢谱图中的各个峰进行归属，可以看出图谱中出现了环肽的特征峰，即酰胺健上的氢和苯环上的氢，这是PEG-PCL载体上没有的峰，证明靶向环肽和载体已经成功地连接上了。

图2 c(RGDfC)-PEG-PCL的1H-NMR谱图

2.3 反应时间对c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影响

时间对c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影响如图3所示。由图3可知，在0～12 h内，c(RGDfC)-PEG-PCL的合成率快速上升，在此阶段反应迅速，产物迅速积累；在12～24 h内，c(RGDfC)-PEG-PCL的合成率缓慢上升，在此阶段反应逐渐减慢，产物积累缓慢；在24～28 h内，c(RGDfC)-PEG-PCL的合成率几乎不变，在此阶段反应停止，产物不再积累。这可能是因为随着反应的进行，反应物的浓度降低，产物积累变慢。所以，选择反应时间为24 h，c(RGDfC)和Mal-PEG-PCL的反应结束。

2.4 pH值对c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影响

pH值对c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影响如图4所示。由图4可知，pH在7.5～8.0之间，c(RGDfC)-PEG-PCL的合成率达到最高；pH高于8.0时，随着pH的增大，c(RGDfC)- PEG-PCL的合成率降低。这是由于碱性条件有利于加成反应的进行，但碱性过高会导致副产物的生成，因此最佳pH在7.5～8.0之间。

图3 时间对c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影响 图4 pH值对c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影响

2.5 温度对c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影响

温度对c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影响如图5所示。由图5可知，在温度为25 ℃时，c(RGDfC)-PEG-PCL的合成率达到最高；当温度高于25 ℃时，随着温度的升高，c(RGDfC)- PEG-PCL的合成率降低，这是由于提高温度会增强迈克尔加成反应的逆反应，不利于合成产物c(RGDfC)-PEG-PCL的积累，所以，选择在25 ℃左右为最佳反应温度。

2.6 催化剂对c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影响

催化剂对c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影响如图6所示。由图6可知，在反应中加入碱性催化剂DIEA可以提高c(RGDfC)-PEG-PCL的合成率。由于碱性催化剂有利于反应物去质子形成阴离子，促进迈克尔加成反应的进行[12]，所以加入DIEA能够促进c(RGDfC)-PEG-PCL的合成。

图5 温度对c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影响 图6 催化剂对c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影响

2.7 不同溶剂对c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影响

不同溶剂对c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影响如图7所示。由图7可知，用DMF作为溶剂时，c(RGDfC)-PEG-PCL的合成率最高，这是由于多肽c(RGDfC)和Mal-PEG-PCL在DMF中能够溶解完全，有利于反应的进行；用甲醇作溶剂时，由于有部分反应物无法溶解，导致c(RG DfC)-PEG-PCL的合成率降低；用DCM作溶剂时，c(RGDfC)-PEG-PCL的合成率最低，这可能是由于在反应过程中，DCM挥发导致反应物出现沉淀，进而导致c(RGDfC)-PEG -PCL的合成率降低；二甲基亚砜作为反应溶剂，c(RG DfC)-PEG-PCL的合成率与DMF相差不大。因此，选用DMF作为反应溶剂，c(RGDfC)- PEG-PCL的合成率最高。

图7 不同溶剂对c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影响

3 结论

采用迈克尔加成法，在反应时间为24 h、pH值在7.5～8.0、温度为25 ℃、加入碱性催化剂DIEA、用DMF作为反应溶剂的最佳反应条件下，将靶向环肽c(RGDfC)连接到载体Mal-PEG -PCL上，制备出具有肿瘤主动靶向性的纳米载体——c(RGDfC)-PEG-PCL。控制反应时间为24 h，保证了反应完全的同时，提高了实验效率；调节pH在7.5～8.0，碱性环境下有利于迈克尔加成反应的进行；控制温度为25 ℃，有利于减少逆反应的发生，保持多肽的活性，提高合成率；加入碱性催化剂有利于巯基失去质子，形成阴离子，促进反应的进行；用DMF作溶剂，在保证原材料完全溶解的同时，有利于产物的回收。该靶向纳米载体制备工艺简单、生物相容性优良、靶向效果显著，为肿瘤的精准治疗提供了新的思路。