高效液相色谱法测定酚酞片中的7个杂质

聂忠莉， 赵树敏， 王晓玲， 赵玉玲， 张 勇， 萧茂玲(.成都大学 药学与生物工程学院， 四川 成都 6006； .成都克莱蒙医药科技有限公司， 四川 成都 6004)

0 引 言

酚酞片主要成分是酚酞[1]，临床上常用于治疗习惯性顽固性便秘.酚酞为刺激性倾泻性，主要作用于大肠，口服后在肠道碱性环境中形成可溶性钠盐，刺激肠壁内神经丛，直接作用于肠道平滑肌，使肠蠕动增加.同时酚酞又抑制肠道内水分的吸收，使水和电解质在结肠蓄积，产生缓泻作用，其作用与肠中碱性大小有关，且其作用温和，很少引起肠道痉挛[2].

酚酞的制作主要由邻苯二甲酸酐和苯酚反应合成.相关研究表明，酚酞在合成过程中，未完全反应的起始原料、反应的中间体、反应副产物和分解产物以及参与反应的试剂可能引入杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I及杂质J 10种杂质，分别为邻苯二甲酸酐、苯酚、荧光母素、2-羟基蒽醌、2-(4-羟基苯甲酰)苯甲酸、1-羟基蒽醌、酚酞啉、邻苯二甲酸、芴和苯酞[3].《中国药典》2015年版二部[4]收载酚酞片的杂质检查项是采用薄层色谱法控制荧光母素的限度[5-6].本实验是采用高效液相色谱法对酚酞片中可能存在的7个已知杂质(包括杂质A、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G及杂质I)含量进行控制研究，结果表明该方法具有合理性和有效性.

1 材料与仪器

1.1 材 料

实验所用材料包括：邻苯二甲酸酐(杂质A)(批号，906637-LJC0Q81，含量为99.79%)、芴(杂质I)(批号，334723-L8809，含量为98%)，购自北京百灵威科技有限公司；荧光母素(杂质C)(批号，100075-201303,含量为100%)，购自中国食品药品检定研究院；2-(4-羟基苯甲酰)苯甲酸(杂质E)(批号，FCC17197，含量为98.97%)、1-羟基蒽醌(杂质F)(批号，FCB044533，含量为95%)，购自英国Fluorochem公司；2-羟基蒽醌(杂质D)(批号，IBQBD-FAH1012,含量为97.4%)、酚酞啉(杂质G)(批号，18095-LVSKC-CB,含量为99.1%)，购自东京化成工业株式会社；酚酞片(批号，20170904、170802、180501、180502、180503，规格为50 mg/0.1 g)，购自四川省通园制药有限公司；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水.

1.2 仪 器

实验所用仪器包括：1410高效液相色谱仪(日立(中国)有限公司)，BP-210D型精密电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司，756CRT型紫外分光光度计(上海佑科仪器仪表有限公司)，Kelisonic超声清洗仪(深圳市科力超声波洗净设备有限公司).

2 方法与结果

2.1 溶液的配制

2.1.1 各杂质贮备液的制备.

精密称取杂质A、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G及杂质I对照品适量，于100 mL容量瓶中加乙腈溶解并稀释至刻度，制成1 mL中含各杂质0.5 mg的乙腈溶液，作为各杂质贮备液.

2.1.2 定位溶液.

取各杂质贮备液200 μL加乙腈稀释至1 mL作为定位溶液.

2.2 色谱条件

实验的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.01 mol/L磷酸氢二甲溶液的0.1%醋酸水溶液—乙腈(90∶10)为流动相A，0.01mol/L磷酸氢二甲溶液的0.1%醋酸水溶液—乙腈(30∶70)为流动相B，进行梯度洗脱，洗脱条件[7]见表1；检测波长为270 nm，柱温40 ℃，流速1.0 mL/min.

表1 洗脱条件表

2.3 系统适用性

精密称取酚酞片(批号，20170904)细粉约11.23 mg，置10 mL的量瓶中，再另取“2.1”项下杂质A、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G及杂质I贮备液各40 μL同置上述10 mL量瓶中，加乙腈至刻度，摇匀，即为系统适用性溶液.精密量取20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图如图1所示.

图1 系统适用性实验色谱图

由图1可知，杂质E、杂质A、杂质G、酚酞、杂质D、杂质F、杂质C及杂质I依次出峰，主峰及各杂质峰保留时间的RSD均小于1.0%，峰面积的RSD小于2.0%，杂质峰之间的分离度均远大于1.5，拖尾因子也在较好范围内，表明本方法系统适用性好，可进一步进行研究.

2.4 酚酞片提取条件的选择

精密称取酚酞片(批号，170802)细粉约15 mg，共3份，分别置于10 mL量瓶中，加乙腈适量，分别超声处理1、2、5 min，放冷后定容.各取2 mL离心(转速为10 000 r/min)10 min，得上清液，另取2 mL用0.45 μm有机滤膜过滤，得续滤液，精密量取上清液、续滤液各20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图.结果表明，6种提取方法的结果基本一致，故任选一种作为酚酞片提取处理的方法，即超声处理1 min后，再离心(转速为10 000 r/min)10 min，得上清液，作为本片测定的供试品溶液.

2.5 定量限、检测限

取“2.1”项下各杂质贮备液，分别加乙腈稀释至系列浓度的供试品溶液，按照“2.2”项下的色谱条件，分别精密量取20 μL进行测定，计算当各杂质响应值约为基线噪音的3倍和10倍时的进样量，结果计算出，杂质A、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G及杂质I的定量限分别为25.194 ng、9.881 ng、0.721 ng、6.899 ng、3.863 ng、11.989 ng、5.433 ng；检测限分别为8.755 ng、2.430 ng、0.201 ng、3.265 ng、1.157 ng、3.965 ng、2.979 ng.

取相当于定量限浓度的供试品溶液，连续进样6次，考察其重现性.结果表明，各峰保留时间RSD值均小于0.1%，峰面积RSD值均小于5.0%，表明重现性较好.

2.6 专属性

取酚酞片细粉(批号，170802)，分别进行高温、氧化、酸、碱及光照破坏实验，考察各杂质的降解情况.结果表明，空白溶剂无干扰；破坏产生的杂质与主峰，以及杂质与杂质之间分离度均在1.5以上，能达到完全分离，主峰峰纯度均达到0.999，杂质峰峰纯度基本均达0.99以上；各破坏样品的物料平衡均在98%～117%之间.实验表明，该方法专属性良好，能检测出本品在储藏和运输过程的极端条件下产生的降解产物.

2.7 线性关系

取“2.1”项下各杂质贮备液用乙腈逐级稀释得到系列杂质溶液，考察其浓度与峰面积的线性关系.结果表明，在1 μg/mL～23 μg/mL的浓度范围内，各杂质峰面积与样品浓度呈良好的线性关系，相关系数均达到0.999.

2.8 回收率

分别精密称取酚酞片(批号，170802)细粉约15 mg，共10份，其中1份置10 mL量瓶中，加乙腈适量，超声1 min，用乙腈稀释至刻度，摇匀，离心(转速为10 000 r/min)10 min后，得上清液，作为供试品空白溶液.另9份分别分成3组，分别加入“2.1”项下各杂质贮备液20 μL、40 μL、60 μL，每组3份，加乙腈适量，超声1 min，用乙腈稀释至刻度，摇匀，离心(转速为10 000 r/min)10 min后，得上清液，分别作为回收率50%、100%、150%的供试品溶液.分别精密量取20 μL，注入液相色谱仪.另精密量取“2.1”项下各杂质贮备液0.8 mL于200 mL容量瓶中，加乙腈至刻度稀释成1 mL中含各杂质2 μg的溶液，作为对照品溶液，同法测定.计算供试品溶液中各杂质的含量，并扣除酚酞中各杂质的含量，计算回收率.结果表明，杂质A、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G及杂质I 7个杂质的平均回收率分别为101.94%、103.02%、101.63%、100.87%、100.98%、99.11%、101.67%，RSD值分别为1.47%、2.31%、1.76%、1.06%、1.15%、0.74%、1.38%，表明了在该条件下，各杂质的回收率良好，准确度高.

2.9 重复性

精密称取酚酞片(批号，170802)细粉6份，每份约15 mg，置10 mL量瓶中，分别精密加入“2.1”项下各杂质贮备液40 μL，加乙腈适量，超声1 min，用乙腈稀释至刻度，摇匀，离心(转速为10 000 r/min)10 min后，得上清液，作为供试品溶液.分别精密量取20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图.另精密量取“2.1”项下各杂质贮备液0.8 mL，加乙腈稀释成1 mL中含各杂质2 μg的溶液，作为对照品溶液，同法测定.计算6份样品中各杂质的含量，并计算RSD.结果表明，杂质A、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G及杂质I 7个杂质的RSD值分别为3.81%、1.57%、1.38%、1.57%、1.96%、1.51%、3.81%，表明本方法的重复性好.

2.10 中间精密度

由不同分析人员在不同时间，采用不同仪器对同一批样品的6份供试品溶液进行测定.结果表明，杂质A、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G及杂质I 7个杂质的RSD值分别为4.16%、4.90%、4.95%、1.75%、1.84%、4.78%、3.85%，表明中间精密度良好.

2.11 稳定性

以回收率项下的100%-1#溶液，作为供试品溶液.分别在0、13、17、36 h注入液相色谱仪，记录不同时刻样品中各杂质的峰面积，并计算RSD.结果表明，杂质A、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G及杂质I 7个杂质的RSD值分别为0.76%、1.29%、1.13%、1.03%、1.32%、2.32%、1.30%，表明了在36 h内溶液的稳定性良好.

2.12 耐用性

精密称取酚酞片(批号，170802)细粉约15 mg，置10 mL量瓶中，分别精密加入“2.1”项下各杂质贮备液40 μL，加乙腈适量，超声1 min，用乙腈稀释至刻度，摇匀，离心(转速为10 000 r/min)10 min后，得上清液，作为供试品溶液.量取“2.1”项下各杂质贮备液40 μL，用乙腈溶解稀释至10 mL作为对照品溶液.分别精密量取上述溶液各20 μL，在柱温、流速、色谱柱及检测波长等进行微小变动的条件下，进样测定，记录色谱图，按外标法计算各杂质的含量，并计算RSD.结果表明，杂质A、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G及杂质I 7个杂质的RSD值分别为4.21%、4.90%、4.81%、2.90%、2.72%、4.83%、3.87%，表明本方法耐用性良好.

2.13 样品测定

取酚酞片细粉约15 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，加乙腈适量，超声1 min，用乙腈稀释至刻度，摇匀，离心(转速为10 000 r/min)10 min后，得上清液，作为供试品溶液.另取各杂质杂质A、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G及杂质I适量，加乙腈制成1 mL各含杂质2 μg混合溶液作为对照品溶液.分别精密量取上述各溶液20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图.供试品溶液色谱图中如有与对照品溶液色谱图中杂质峰保留时间一致的峰，按外标法计算各杂质的含量，含各杂质应不得过0.1%.各批样品检测结果见表2.

表2 各批样品检测结果

由表2可知，2个规格共6批样品均只检出有关杂质C,且杂质C的含量均小于0.1%，均未检出其他有关杂质和未知杂质，因此2个规格共6批样品结果符合规定.

3 讨 论

本研究采用可见—紫外分光光度计，在200～400 nm波长范围内扫描，对各杂质的吸收波长进行了考察.结果表明，杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I及杂质J在220 nm、250 nm、270 nm波长处均有吸收，综合各杂质看，每个杂质在270 nm波长处有最大吸收，所以将各杂质的测定波长拟定在270 nm波长处.

由于杂质D、杂质F及杂质I在各批样品中均未检出，在稳定性考察过程中也未见增加趋势，所以仅作研究，未收载入质量标准.杂质C在各批样品中均可检出，杂质A、杂质E及杂质G在碱破坏条件下均有产生，所以将杂质A、杂质C、杂质E和杂质G收载入质量标准，限度为不得过0.1%.

本研究通过对杂质A、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G及杂质I测定方法进行了方法学研究，其专属性、定位试验、系统适用性、定量限、检测限、回收率、重复性、中间精密度、稳定性及耐用性均达到良好的效果，表明所采用的分析方法是科学的、合理的，并能有效控制酚酞片中各杂质的含量.《中国药典》2015年版二部收载的酚酞片质量标准中，仅对荧光母素(杂质C)的含量进行限度控制，采用的是薄层色谱法，而本研究中采用高效液相色谱法对杂质A、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G及杂质I进行含量控制，该测定方法优于现行药典中给出的相关检测方法.