结核分枝杆菌rpoB基因突变检测

尹冬梅

【摘  要】目的：通过PCR和测序法检测rpoB基因利福平耐药区域（RRDR）是否存在突变并测定其突变位点。方法：收集临床分离结核杆菌DNA检测阳性标本，通过PCR技术扩增其rpoB基因，扩增产物测序，并将测序结果提交至NCBI数据库中对比。结果：30例结核DNA阳性标本中，有25例rpoB 基因PCR 扩增阳性者， 有18例测序成功，与PUBMED BLAST中标准菌株rpoB基因对比，存在突变的菌株有10例，没有突变的菌株有8例，突变率为55.56%，突变核心区域突变率为90.0%。结论：rpoB 基因PCR 检测在可辅助诊断结核病的同时， 对其产物进行测序可直接判别对利福平耐药与否，能给临床提供快速用药指导。

【关键词】结核分枝杆菌;PCR;rpoB基因;利福平耐药

【中图分类号】R454      【文献标识码】A      【文章编号】1672-3783（2019）03-0047-02

结核病是艾滋病病毒感染者和患者常见的机会性感染和主要死亡原因^[1]近年来，我国的结核病发病率和耐药率均有上升趋势，尤其是耐多药结核病和非结核分枝杆菌病及艾滋病并发的结核病的疫情十分严峻，并严重损害着人们的健康^[2]。对疑似结核病患者，首先需快速确定结核分枝杆菌感染，在此基础上，再对其耐药性进行快速检测。因此，只有建立快速、准确的耐药性检测方法，对异烟肼、利福平耐药结核病的早期诊断和指导临床用药才具有实用性。

1 实验对象

1.实验材料

1.1实验菌株

结核分枝杆菌DNA阳性结果的标本收集来自于2017年1月至2017年5月四川省人民医院住院或门诊患者分离的无重复的标本，其中支气管肺泡灌洗液15例，痰液12例，清洁中段尿2例，血液1例。

1.2主要材料及试剂

2×Taq Mixture、LA Taq 高保真DNA聚合酶、dNTPs、5×LA Taq Buffer Ⅱ（Mg²⁺plus）（TaKaRa）;100bp DNA Ladder （ 北京天根）;GoldviewⅠ型核酸染色剂：琼脂糖（Biowest）;各种引物由成都擎科梓熙生物公司合成。

1.3主要溶剂配制

（1）5×TBE缓冲溶液（1000ml ）：

硼酸27.5g，Na2EDTA.2H2O 3.72g加入800ml去离子水，玻璃棒搅拌溶解，定溶1000ml，常温保存。

（2）琼脂糖凝胶

称量0.5克琼脂粉至烧瓶中，加入50ml0.5×TBE缓冲液。加热2分钟至沸腾，冷却至60-70℃，加入5 ?l GoldviewⅠ型核酸染色剂，充分混匀。将琼脂液注入凝胶池，放置“梳子”，待30min后，其冷却凝固成型，拔掉梳子备用。

1.4主要仪器

超净工作台（上海Boxun）;生物安全柜;PCR扩增仪PTC-200（美国Bio-Rad公司）、微量移液器、电子天平（上海民桥精密仪器厂）;电泳仪（Sanvant）;凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）;普通冰箱（中国海尔）、低温冰箱（SANYO）。

2 实验方法

2.1标本收集及处理

留取标本3～5ml 于有盖灭菌容器中。加2倍体积1N NaOH 溶液碱化痰液， 吸取500μl 标本混悬液移入0.5ml离心管内， 1500rpm离心10min。吸弃上清液，加裂解液A 50μl， 裂解液B 2μl混匀， 置55℃保温1h 后改95℃保温10min， 10000rpm离心30s。

2.2荧光定量PCR 检测确认结核分枝杆菌

反应体系：10×PCR buffer 5.0?l，MgCl2（25 mmol/l）7.0 ?l，dNTPs（2.5 mmol/l）3.0?l，dUTP（10 mmol/l）2.0?l，MTB 上下游引物（20μmol/l）各1.5?l，探针（10μmol/l）1.0?l，UNG 酶（1U/?l）0.5?l，Taq 酶（5U/?l）0. 5?l，模板25?l，补水至50?l。反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 3 min;95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，共40 個循环。以结核分枝杆菌H37Ra 为参考菌株，PCR 扩增IS6110基因，将稀释至10⁷copies/ml 的DNA 作为强阳性标准品，稀释至10³copies /ml 的DNA 作为弱阳性标准品。

2.2 PCR扩增结核分枝杆菌rpoB基因片段

根据结核分枝杆菌标准菌株H37Rv的rpoB基因标准序列信息（从NCBI获得），利用引物rpoB（5CAGACGTTGATCAACATCCG3）和rpo4（5TACGG CGTTTCGATGAAC3），扩增含有81bp利福平耐药决定区（RRDR）的305bp片段。PCR在MJ微型热循环仪中进行，实验所用反应体系（50?l）： 2×Taq Master-Mix 25?l，前引物和后引物（F、R）各0.5?l，模板DNA 2?l，DH2O 22?l。具体反应条件为92℃预变性3min，92℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，如此30个循环，最后72℃延伸5mim。获得的基因产物4℃冰箱保存备用。产物经1% 琼脂糖凝胶电泳后Bio-Rad凝胶成像仪检测，根据条带结果确定有无目的基因。

2.3扩增后基因产物电泳凝胶成像并分装及测序

扩增后的基因产物分别进行琼脂糖凝胶电泳。方法：将新倒好的凝胶放入电泳槽中，加样孔一侧放在负极端（共8孔），向第一孔加入5?l DNA Marker，其余加样孔中分別加入DNA扩增产物5?l。通电，120V，100mA，电泳30分钟。电泳完成后将胶板放入凝胶成像仪（Bio-Rad）中，观察电泳条带的清晰程度以及位置。确认基因的存在。对电泳成功剩余的扩增产物装进EP管内，做好基因以及标本号的标记并用封口胶封住。放入冰箱保存，待下一步的序列分析。

2.4 PCR产物凝胶回收

PCR产物和酶切产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳后，采用凝胶回收试剂盒，根据说明书提供的方法进行产物回收。

2.5对扩增基因产物进行序列比对及分析

将纯化后的PCR扩增产物送交由成都擎科梓熙生物技术有限公司进行DNA测序，将测序结果用软件与PUBMED BLAST的rpoB基因标准序列比较分析，确定突变位点和类型。

3 结果

3.1 pcr扩增结果

如图（1），预实验选取1000bpDNA ladder做为makker，第二孔为阴性对照孔，后面依次为随机选择的标本。可以看出makker和部分标本是能扩增出条带的，实验条件是可行的，可以继续进行实验。

30例结核DNA阳性标本中，有25例rpoB 基因PCR 扩增阳性者， 将这25例pcr条带进行提纯。提纯后的标本送至成都擎科梓熙生物公司进行测序。

Lane 1： 1000bp DNA Ladder     Lane 2： 结核DNA阴性的标本

Lane 3：标本3-2          Lane 4：标本3-1

Lane 5：标本2-1         Lane 6：标本2-2

Lane 7：标本2-3         Lane 8：标本2-4

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3.2 测序结果

实验扩增产物在预实验成功后进行封存，交由成都擎科梓熙生物技术有限公司测序。序列结果如期返回，其结果显示有18例扩增产物都可以得到基因有效序列，截取每个基因在长度0-350bp区间的序列图，分析结果如下。

3.3 比对结果

对包含RRDR 耐药决定区的305 bp rpoB 基因扩增片段进行DNA 测序。如表1

3 讨论

利福平（RFP），是常用的一线抗结核药物之一。利福平通过和结核菌中DNA转录依赖的RNA聚合酶的结合来抑制转录过程，导致细胞死亡^[3]。耐药结核的出现常常导致结核患者治疗的失败与死亡，快速检测结核药敏，对结核患者临床用药有十分重要的指导意义。本文对标本进行rpoB 基因PCR 扩增和测序共需时间3 天。耗时远较常规方法为短。为结核病患者在第一时间合理治疗赢得了宝贵时间。将分子学方法与快速药敏实验相结合，为临床提供快速的用药指导具有重要意义。

参考文献

[1]      糜祖煌， 秦玲.结核分支杆菌3 种不同靶基因传统PC R、巢式PC R 检测比较研究.中国优生与遗传杂志， 2002 ， 10（1）：28 -30

[2]      李国利. 结核分枝杆菌耐药分子机制及耐药基因检测方法研究进展[J]. 中国医师杂志， 2002， 4（4）： 338-342.

[3]      李群， 王晓萌. WHO 浙江省结核病耐药监测研究报告[J]. 中华结核和呼吸杂志， 2000， 23（12）： 718-721.