4种不同破红液对血性胸水富集瘤细胞效果的研究

曾赛凡，王雪丹，陈余朋，张 声，王行富

人体几乎所有系统的恶性肿瘤都可能发生浆膜腔播散，以肺癌、胃肠癌、乳腺癌、卵巢癌等多见，其中肺腺癌的转移最常见[1]，多由肿瘤细胞破坏或瘤栓阻塞淋巴管、血管引起，因此常形成血性浆膜腔积液。通过浆膜腔积液细胞学检测往往可进行早期诊断，积液沉渣细胞蜡块制作是重要的补充诊断方法，但由于血性积液中含有大量红细胞，可能掩盖肿瘤细胞，对后续的免疫细胞化学染色和分子检测均可造成困扰。因此，制片前溶解红细胞，使得肿瘤细胞更为集中，并保持完整的细胞形态和良好的抗原性尤为重要。本研究采用4种常见的低渗红细胞裂解液进行处理，比较研究对苏木精-伊红染色(hematoxylin-Eosin stain，H-E)及免疫细胞化学染色(immunocytochemical stain，ICC)的效果，报道如下。

1 资料与方法

1.1样本来源 收集2017年11月-2018年6月送检并经组织病理证实为肺腺癌的浓血性胸水样本22例，男性15例，女性7例，年龄(48.50±4.50)岁(45～60岁)。

1.2方法

1.2.1分组 根据所用的破红液的种类分为4组：A组采用1%乙酸液；B组采用50%乙醇液；C组采用50%乙醇+10%中性缓冲甲醛混合液；D组采用1%乙酸+50%乙醇+10%中性缓冲甲醛混合液，配制后备用。收到样本后立即摇匀，取4管，各10 mL，分别加入4种破红液，样本与破红液的比例是1∶4，在振荡器中1 500 r/min充分混匀后，置于离心机中，2 500 r/min离心5 min，可见管底析出沉淀物，再加10%中性缓冲甲醛悬浮固定5 min，离心弃上清液，加75%乙醇混匀立即离心，弃上清液，加入95%乙醇室温静置2 h，凝集成块后取出，用绵纸包裹，脱水包埋制成细胞蜡块(cell block，CB)，4 μm切片，行H-E染色及ICC染色。

1.2.2ICC染色 采用ULtraVIEW两步法检测系统进行检测，于全自动免疫组织化学染色仪(Roche BenchmarkXT，瑞士罗氏公司)中完成。检测指标：甲状腺转录因子1(TTF-1，1∶200，8G7G3/1，鼠单抗，北京中杉公司，细胞核)、低分子量角蛋白(CK7，1∶300，OV-TL12/30，鼠单抗，福州迈新公司，细胞质)、上皮细胞表面糖蛋白(MOC-31，1∶100，鼠单抗，福州迈新公司，细胞膜)，阳性对照为肺腺癌组织切片。

1.3评价标准 由两名副主任病理医师阅片，评估H-E中红细胞的数量、肿瘤细胞分布和结构及染色分值(表1)，ICC染色时阳性定位、强度及背景分值(表2)。每张染色片按得分评价：效果差为0～3分(白标)，效果一般为4～6分(灰标)，效果优良为7～9分(蓝标)，根据这3种分值制作标记图。

表1 细胞蜡块H-E染色结果评价

1.4统计学处理 采用SPSS 23.0软件进行统计学分析，非正态分布的数据采用中位数和四分位间距M50(P25～P75)描述，不服从参数检验条件时采用秩和检验比较4组破红液作用效果的差异。所有P值为双侧概率检验，检验水准α为0.05。P<0.001为差别具有统计学意义。

表2 肿瘤细胞ICC染色结果评价

2 结 果

2.1H-E染色效果 4组破红处理后，H-E染色镜下均未见或仅有少量的红细胞，肿瘤细胞可见。但A组肿瘤细胞肿胀、核染色质分散，结构略模糊，染色过红；B组肿瘤细胞量少，蛋白背景多，结构清晰略有收缩，染色过红；C组肿瘤细胞多分布均匀，轮廓清晰，形态完整、染色鲜艳；D组部分细胞肿胀、细胞核固缩，染色不均匀(图1)。C组在H-E染色中效果优良蓝色标记最多，D组和B组次之，A组最差(图2)。4组破红液在H-E染色中的比较，差别均具有统计学意义(P<0.001，表3)。

2.2ICC染色效果 A组TTF-1只有2例弱阳性，20例未表达，细胞质表达弥散，背景明显，细胞膜表达尚可；B组细胞量少呈现阳性或弱阳性表达；C组细胞呈均匀一致的棕褐色、阳性细胞数量多、无背景；D组肿瘤细胞表达不均匀，细胞核呈棕黄色、细胞质和膜表达过强，背景明显(图1)。C组在抗原定位、阳性强度、背景干净方面效果优良蓝色标记最多，D组次之，A组和B组较差(图2)。4组破红液在TTF-1,CK7及MOC-31染色中的比较，差别均具有统计学意义(P<0.001)(表3)。

表3 4组破红液H-E及ICC染色效果秩和检验结果对比

3 讨 论

肺腺癌转移至胸腔产生的血性胸水，因所含的红细胞量的差异肉眼可呈现深浅不一的红色，对于深红色的浓血性胸水常因取材时血细胞过多、而有效肿瘤细胞较少或缺如，从而造成漏诊或假阴性[2]。如何破坏红细胞，使得样本分层富集肿瘤细胞，是提高此类样本的细胞病理检出率的关键所在。血性样本的破红常常在细胞涂片上进行处理，破红后制作细胞蜡块的文献相对较少[3]。关于体液样本分离红细胞采用新型环保裂解剂、过滤装置技术、Carnoy固定剂及生理盐水水化技术(normal saline rehydration, NSRT)，均获得一定的效果[4-6]，但操作技术要求及实验成本较高。本研究尝试使用常见的破红试剂，经反复实验及组合运用，寻找既能消除红细胞又能让肿瘤细胞形态相对保存完整的红细胞溶解剂。

1%乙酸和50%乙醇作为低渗性的红细胞溶解剂，溶血效果优良。但在单独使用时对肿瘤细胞的影响明显，乙酸会引起肿瘤细胞的膨胀和细胞核的肿胀[7]，乙醇会大量地沉淀蛋白，使得肿瘤细胞分散，细胞轻度收缩。本实验尝试了混合破红液，D组中乙酸和乙醇同时分离红细胞，破红的速度最快，乙酸对肿瘤细胞的膨胀和乙醇的收缩作用可以部分抵消，但乙酸和甲醛作为固定剂时的穿透速度比乙醇快，所以部分被及时固定的有核细胞形态完整，蛋白保存尚可，而部分细胞肿胀细胞核收缩。C组中，甲醛液具有渗透能力强、固定均匀、组织收缩小的特点，加上50%乙醇可以消除红细胞背景，沉淀蛋白形成支架，细胞聚集成块，二者协同起到固定肿瘤细胞及溶解红细胞的作用。而且10%中性缓冲甲醛可快速穿透固定肿瘤细胞，避免了乙醇对肿瘤细胞的收缩影响。甲醛与乙醇混合液的配制，二者间不同的混合比例、混合时长等均会造成其分子结构的变化及对组织细胞蛋白质效应的差异[8]。实验结果显示，50%的乙醇与10%中性缓冲甲醛混合效果良好。10%中性缓冲甲醛液对于保存细胞的形态和抗原方面更有优势，尤其是对细胞核的固定最佳[9]。本实验在抗体标记的定位与强度方面与组织标本有高度的一致性。

A1：H-E染色，肿瘤细胞肿胀、核染色质分散，结构略模糊，染色过红；A2：TTF-1细胞核未表达；A3：CK7细胞质表达弥散；A4：MOC-31细胞膜表达良好；B1：H-E染色，肿瘤细胞分布于蛋白背景中，细胞收缩，染色过红；B2～B4：TTF-1，CK7及MOC-31肿瘤细胞少量阳性或弱阳性表达；C1：H-E染色，肿瘤细胞分布均匀，形态完整、染色鲜艳；C2～C4：TTF-1，CK7及MOC-31肿瘤细胞呈棕褐色均匀一致的表达；D1：H-E染色，肿瘤细胞肿胀、细胞核固缩，染色不均匀；D2：TTF-1细胞核呈棕黄色表达；D3～D4：CK7及MOC-31肿瘤细胞表达过强，背景明显.

图2 22例样本H-E及ICC染色分值标记图

深红色血性胸水的送检、取材、破红、CB制作应及时，以免造成蛋白大量沉淀、红细胞包裹有核细胞、肿瘤细胞退变等。本次实验中，样本21号和22号的分值低，破红效果不良，可能是送检不当导致细胞退变引起结构破坏，ICC染色出现特异性着色或不着色，与文献报道一致[10]。

总之，针对深红色血性胸水的样本，不同的破红液对制作细胞蜡块H-E染色及ICC染色效果不尽相同，50%乙醇与10%中性缓冲甲醛混合液进行破红的效果最佳，可能具有推广应用的价值，但尚需进一步更多样本及多中心研究，同时，其针对分子病理的影响也需要进一步研究验证。