妊娠期肝内胆汁淤积症患者血清中miR-21和IGFBP-3的表达及与围生儿结局的关系

谢艳华，高岩，何雪莲

妊娠期肝内胆汁淤积症（intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP）是常见的妊娠晚期并发症，产后可自愈，常见临床症状为瘙痒、黄疸[1]。ICP发病率约为0.1%～15.6%，血清总胆汁酸是其诊断敏感指标，多数ICP预后良好，但胆汁酸升高引发的代谢毒性会增加早产、胎死宫内、剖宫产、羊水粪染等围生儿不良结局的发生率，严重影响孕妇及胎儿健康[2]。微小RNA（microRNAs，miRNAs）参与多种疾病的发生发展，并在多种疾病中高表达，与患者激素表达水平密切相关[3]。胰岛素样生长因子结合蛋白3（insulinlike growth factor binding protein-3，IGFBP-3）由肝脏合成，有研究发现IGFBP-3含量在妊娠期变化较为明显，并与胰岛素样生长因子1（IGF-1）有关[4]。但关于miR-21和IGFBP-3的表达对围生儿结局影响的研究较少。本研究旨在探讨ICP患者血清miR-21和IGFBP-3的表达及与围生儿结局的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2017年1月—2018年5月四川省妇幼保健院（我院）产科收治的62例ICP患者作为研究组，同期健康体检孕妇62例为对照组，收集产前静脉血。纳入标准：①符合ICP诊断标准[5]；②单胎妊娠；③对本研究目的、方法有详细了解，自愿参与，并签署知情同意书；④经我院伦理委员会审核批准。排除标准：①合并妊娠期糖尿病、妊娠期高血压及严重子痫前期等产科疾病者；②合并胆管阻塞、胆囊疾病者；③合并肝功能障碍者；④合并其他原因引起的皮肤疾病者；⑤语言表达障碍及精神障碍者；⑥合并严重心、肺、肾等实质器官功能衰竭者；⑦依从性差者。2组孕妇年龄、孕次、初产妇比例比较，差异无统计学意义（均P＞0.05），见表1。

表1 2组孕妇一般情况比较

1.2 试剂与仪器Trizol购自美国Invitrogen公司，逆转录试剂盒购自立陶宛Fermentas公司，SYBR Green聚合酶链反应（PCR）试剂盒购自美国Thermo公司，微量核酸测定仪购自德国Eppendorf公司，PCR仪购自美国ABI公司，ABI7500荧光定量PCR仪购自美国Applied Biosystems公司，紫外凝胶成像分析系统购自美国Gene公司，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 方法总RNA提取自待测血清，于无RNase离心管中加入Trizon提取RNA，操作步骤严格参照试剂盒说明书执行，测定浓度与纯度。逆转录合成冰盒上溶解试剂，配制反应体系，体系为：RNA-Primer Mix 12 μL，25 mmol/L dNTPs 1 μL，5×RT Reaction Buffer 5 μL，200 U/μL M-MLC Rtase 1 μL，25 U/μL RNase Inhibitor 1 μL，ddH2O4μL，总体积 25 μL，反应条件：37℃60 min，85℃ 5 min，4℃5 min；置于-20℃低温保存备用。

实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测miR-21、IGFBP-3分别以U6、GAPDH为内参基因，合成cDNA为模板，反应体系：SYBR Green Mix 12.5 μL，上游引物 0.5 μL，下游引物 0.5 μL，ddH2O 9.5 μL，cDNA 2 μL，反应体积 25 μL，重复 3 次，反应条件：95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；40 个循环，进行PCR扩增，采用2-ΔΔCT方法计算miR-21、IGFBP-3的相对表达量，引物序列见表2。

表2 qRT-PCR扩增引物序列

1.4 统计学方法采用SPSS 19.0统计软件处理实验数据。定量资料用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用两独立样本均数比较的t检验。定性资料用例（%）表示，组间比较采用χ2检验。ICP患者血清miR-21和IGFBP-3表达的关系采用Pearson相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组孕妇血清miR-21和IGFBP-3表达水平比较研究组孕妇血清miR-21表达水平高于对照组，IGFBP-3表达水平低于对照组，差异有统计学意义（均 P＜0.05），见表 3。

表3 2组孕妇血清miR-21和IGFBP-3表达水平比较（±s）

表3 2组孕妇血清miR-21和IGFBP-3表达水平比较（±s）

组别 n miR-21 IGFBP-3研究组 62 2.79±0.57 0.58±0.15对照组 62 1.25±0.23 1.32±0.28 t 19.728 18.343 P 0.000 0.000

2.2 ICP患者血清miR-21和IGFBP-3表达相关性相关性分析显示，ICP患者血清中miR-21表达水平随着IGFBP-3表达水平的升高而降低，两者表达呈负相关（r=-0.783，P=0.000），见图 1。

图1 ICP患者血清miR-21和IGFBP-3表达相关性

2.3 ICP患者miR-21不同表达水平患者围生儿结局比较以ICP患者血清中miR-21表达中位数（2.625）为界值将患者分成miR-21高表达组（30例）和低表达组（32例）。miR-21高表达组患者早产、剖宫产、羊水粪染发生率均高于miR-21低表达组，分娩孕周和新生儿出生体质量低于miR-21低表达组，差异有统计学意义（均P＜0.05）。2组新生儿窒息和胎死宫内发生率比较，差异无统计学意义（均P＞0.05）。见表4。

2.4 ICP患者IGFBP-3不同表达水平患者围生儿结局比较以ICP患者血清中IGFBP-3表达中位数（0.57）为界值将患者分成IGFBP-3高表达组（33例）和低表达组（29例）。IGFBP-3低表达组患者早产、剖宫产、羊水粪染发生率均高于IGFBP-3高表达组，分娩孕周和新生儿出生体质量低于IGFBP-3高表达组，差异有统计学意义（均P＜0.05）。2组新生儿窒息和胎死宫内发生率比较，差异无统计学意义（均P＞0.05）。见表5。

3 讨论

ICP属于妊娠期肝脏疾病，发病具有明显种族和地域差异，国内以上海、重庆、四川等地发病率较高，并呈不断上升趋势[6]。ICP发病因素较多，一般认为与饮食习惯、激素水平、免疫、地理和种族等因素有关，由于致病因素较多，其致病机制尚不明确[7]。目前关于ICP研究主要集中在流行病学分析及激素水平变化影响，而在miRNAs水平及与激素关系的研究较少。本研究期望通过对ICP患者血清中miR-21和IGFBP-3表达水平及对围生儿结局影响的研究，寻求降低围生儿不良结局发生率的思路。

MiRNAs属于小分子非编码单链RNA，具有高度保守性，可调控人类1/3的蛋白编码基因表达，影响巨大。MiRNAs可通过调控下游靶基因发挥生物学效应，不仅参与正常机体细胞增殖、分化和凋亡等生理过程，还参与多种疾病的发生、发展[8]。MiR-21与多种疾病致病过程有关。雷扬等[9]研究发现，miR-21在肝癌和肝硬化患者组织中高表达，并与总胆红素、谷草转氨酶升高有关，可能参与两者的发病过程。Mazzini等[10]研究发现，miR-21在非酒精性脂肪肝患者血清中高表达，miR-21表达抑制时疾病得以改善，表明其表达与代谢有关。IGFBP-3属于IGF家族，是妊娠晚期血浆中含量最高的结合蛋白，随孕周增加而升高[11]。Liao等[12]研究发现，IGFBP-3在妊娠晚期子痫前期患者血清中表达上调，可作为妊娠合并子痫前期的潜在检测指标。赖辉添等[13]研究证实IGFBP-3在矮小症儿童血清中表达水平显著低于正常儿童，说明IGFBP-3与儿童生长发育密切相关。本研究结果显示，研究组孕妇血清miR-21表达水平高于对照组，IGFBP-3表达水平低于对照组，与梁雪莹等[14]研究结果基本相似，提示ICP患者血清中miR-21高表达，IGFBP-3低表达，miR-21和IGFBP-3可能参与ICP的代谢过程。相关性分析显示，ICP患者血清中miR-21与IGFBP-3表达呈负相关，与Yang等[15]研究结果基本相似，提示miR-21可能通过负向调控IGFBP-3参与ICP的发生、发展。进一步研究显示，miR-21高表达组患者早产、剖宫产、羊水粪染发生率均高于miR-21低表达组，分娩孕周和新生儿出生体质量低于miR-21低表达组，2组新生儿窒息和胎死宫内发生率相似，提示miR-21高表达与ICP患者围产儿不良结局密切相关。有研究发现，血清中miR-21高表达ICP患者总胆汁酸含量升高，而总胆汁酸毒性作用可降低胎儿心率，影响胎儿发育，同时胆汁酸淤积可影响维生素K吸收，出现凝血功能障碍，增加ICP患者围生儿不良结局发生概率[16-17]。最后研究显示，IGFBP-3低表达组患者早产、剖宫产、羊水粪染发生率均高于IGFBP-3高表达组，分娩孕周和新生儿出生体质量低于IGFBP-3高表达组，2组新生儿窒息和胎死宫内发生率相似，提示IGFBP-3低表达与ICP患者围生儿不良结局密切相关。IGFBP-3为妊娠晚期IGF-1的主要结合蛋白，IGFBP-3含量降低可引起IGF-1结合率降低，降低IGF-1生物利用度，增加胎儿并发症，而IGFBP-3含量降低还可促进胆汁酸分泌增加，增加围生儿不良结局发生率[18]。因此，miR-21可能通过下调IGFBP-3表达，促进胆汁酸分泌参与ICP的发生发展，其具体作用机制还需进一步研究。

表4 ICP患者miR-21不同表达水平患者围生儿结局比较

表5 ICP患者IGFBP-3不同表达水平患者围生儿结局比较

综上所述，本研究通过对ICP患者血清中miR-21和IGFBP-3表达水平检测显示，ICP患者血清中miR-21高表达，IGFBP-3低表达，两者表达呈负相关，miR-21高表达和IGFBP-3低表达患者围生儿不良结局发生率高，有较高临床指导价值，同时为进一步ICP致病机制研究提供材料支持。由于本研究所选择研究对象有限，可能会对研究结果产生一定误差，在后期研究中会增加样本量，进一步验证。