神曲及其炮制品中5-羟甲基糠醛的含量分析
2019-10-14
(1.中国中医科学院中药研究所，北京 100700；2.国家中药材产业技术体系贮藏与包装岗位，北京 100700)
神曲(Massa Medicata Fermentata, MMF)，又名六神曲，是由辣蓼、青蒿、苍耳、赤小豆、苦杏仁、麦麸与面粉混合均匀后，在25～28℃的温度下发酵7天左右制作而成的曲剂[1,2]，功效为健脾和胃，消食调中，临床上用于脾胃虚弱，饮食停滞，胸痞腹胀，小儿食积。从汉晋到明清都是脾胃气虚证的常用药物[3]，既可单独使用，也可作为饮片配伍制成康儿灵颗粒[4]、胃舒康冲剂[5]等用于临床。神曲对小鼠肠道菌群失调具有调整和保护作用[6]，可以改善小鼠的消化功能[7]，甲醇提取物可以促进巨噬细胞和小肠上皮细胞的活性[8]。研究认为，蛋白酶活力和淀粉酶活力越高，神曲的质量越好[9]。随着神曲发酵时间的延长，噻嗪双酮苷的含量降低，噻嗪双酮的含量先升后降，二者的含量变化可以在一定程度上反映发酵过程及发酵品质[10]。神曲在各地方标准中均有记载，但均未见指标性成分的控制标准。2015版《中国药典》则未收载神曲相关内容。
中药材在贮藏与包装环节，由于贮藏时间的延长，会引起色泽的加深，导致5-羟甲基糠醛(5-HMF)的含量从无到有，从少到多，呈现显著的相关性。如牛膝在简易库和冷藏库贮藏27个月的时间内，5-HMF含量分别升高为0月的14倍和11倍[11]。牛膝从浅黄色泛糖变成黑色时5-HMF的含量升高了近10倍[12]。五味子贮藏2年后，色泽从红色加深为暗红色，5-HMF的含量升高了近6倍[13]。5-HMF的含量范围对于评价中药材的质量具有共性的作用。
神曲在使用时有生、炒、焦等多种炮制品。发酵的曲剂即为生神曲，清炒或者麸炒至表面棕黄色，偶有焦斑，为炒神曲。炒至表面焦黄色，内部微黄有焦香气时，为焦神曲[14]。这种炮制引起色泽的变化，能否通过5-HMF的含量测定来进行质量的评价，尚未见文献报道。本实验收集了多批生、炒、焦神曲，探讨神曲炮制品、不同色泽与5-HMF含量的相关性，以期为神曲质量标准的制定奠定基础。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
Shimadzu LC-20AT型高效液相色谱仪(日本岛津公司)，配有SIL-20A型自动进样器，DGU-20A5型自动脱气机，SPD-M20A型二极管阵列检测器，LC-20AT型泵，CTD-10ASvp柱温箱，LC-solution色谱工作站；XS105 Dual Range型电子分析天平(精度0.01 mg，Mettler Toledo仪器系统有限公司)；Ohaus CP224C型电子天平(精度0.1 mg，平奥豪斯(上海)仪器有限公司)；三恩驰便携式电脑色差仪(NH310型,深圳市三恩驰科技有限公司)；DFT-50A型手提式高速粉碎机(温岭市林大机械有限公司)；KQ-100E超声波清洗器(100 W，40 kHz)(昆山市超声仪器有限公司)。
5-HMF对照品，纯度≥99.09%(美国Sigma-Aldrich公司)；色谱纯甲醇、乙腈[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]；水为娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。各样品购买于药材市场和各地的药店，详见表1。
1.2 方法
1.2.1色泽观察
取各样品适量，粉碎，过四号筛，取适量样品粉末置于白纸上，在日光下观察色泽，结果见表1。
表1 神曲的样品信息、色泽、水分和5-HMF的含量
续表1
1.2.2色泽测定
测定结果见表2。
表2 各样品的色泽测定结果
续表2
1.2.3水分测定
取“1.2.1”项下粉末约2.0 g，精密称定，按2015版《中国药典》通则0832项下烘干法测定水分，含量结果见表1。
1.2.45-HMF的含量测定1.2.4.1色谱条件
Dikma Diamonsil C18(2)色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为乙腈-水(5∶95，v/v)，检测波长284 nm，流速为1 mL/min，柱温为30℃，进样量10 μL。
1.2.4.2对照品溶液的制备
精密称定5-HMF对照品3.97 mg，置于10 mL棕色量瓶中，加80%甲醇使溶解，并加到刻度线，制成浓度为0.397 g/L的对照品溶液。
1.2.4.3供试品溶液的制备
取“1.2.1”项下粉末约1.0 g，精密称定后，置于25 mL具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，超声处理25 min(100 W，40 kHz)，取出放冷至室温，补足减失的重量，滤过，取续滤液过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液即得。供试品与对照品溶液的色谱图见图1。
图1 对照品及红参供试品HPLC图A.对照品；B.供试品；1.5-HMF
1.2.4.4方法学考察
参照文献[13]的方法进行方法学考察，测定了系列浓度对照品溶液中5-HMF的峰面积，以峰面积(mAU)为纵坐标，进样量(μg)为横坐标，计算线性方程为Y=8 037 489X-20 286(r2=0.999 4)，适用的进样量范围在0.001 985～0.397 μg之间。连续6次测定浓度为19.85 μg/mL的5-HMF对照品溶液，计算其峰面积的RSD为0.98%，说明该仪器的精密度良好。取19号供试品粉末6份，每份质量约1.0 g，按照“1.2.4.3”项下所述方法进行供试品溶液的制备，以“1.2.4.1”项下色谱条件进行测定，计算得5-HMF的平均含量为162.3 μg/g，RSD为1.85%，表明该方法的重复性良好。室温下，将该供试品溶液在0、2、4、8、12、24小时分别进样，测定5-HMF峰面积的RSD为1.84%，说明供试品溶液在24小时内稳定。按表3的称样量称重，与2.0 mL浓度为39.70 μg/mL的5-HMF对照品溶液共置于具塞锥形瓶中，制备供试品溶液并测定，计算得平均加样回收率为100.83%，RSD为2.10%，结果见表3。
1.2.4.5样品含量测定
将按照“1.2.4.3”项下方法制备的供试品溶液，按“1.2.4.1”项下的色谱条件分别进样测定，采用外标一点法计算干品中的含量，结果见表1。
表3 5-HMF的加样回收率试验结果
2 结果与讨论
2.1 色泽观察与测定
表1的结果显示，生神曲和炒神曲的色泽较浅，呈黄白、灰白色，两类之间的色泽基本一致，但是焦神曲的色泽较深，为黄褐色，与生、炒神曲的色泽有明显的差别。L*表示亮度，其值越大说明色泽越白，越小说明色泽越黑。结果显示，各样品的L*值变化较大，生神曲和炒神曲样品中，除了2、6号样品外，L*值均大于55；焦神曲的L*值均小于55。色差值(ΔE*)可以客观地表示人眼区分不同样本色泽的能力，数值越大，说明样品色泽与对照物色泽的差异越明显。在15份生神曲和炒神曲样品中，除6号样品以外，ΔE*值均低于40，焦神曲的ΔE*值均高于40。L*和ΔE*值的变化均说明焦神曲的色泽较深，而生、炒神曲色泽较浅，色差仪测定的数据与人眼观察的结果一致。
表2的结果显示，生神曲和炒神曲各样品之间的ΔE*值差异不明显。焦神曲的ΔE*值均高于生、炒神曲。这样的色泽测定结果与人眼所见的结果一致。目前神曲炮制程度的判断完全依赖人眼观察，存在主观和模糊等缺点，色差仪可以给出色泽的具体数值，且操作方便，对于神曲炮制的判断具有重要意义，建议在神曲及其炮制品的制备时应用客观的色差仪进行测定。本实验首次在神曲及其不同炮制品中检测出了5-HMF。
2.2 水分与5-HMF的含量测定
表1的结果显示，各样品的水分含量均低于10%，且变化范围较窄。本实验测定的各种神曲中，水分含量基本一致，说明神曲及其炮制品的水分含量是可控的和稳定的。5-HMF的含量，在生品中的范围为3.933～163.6 μg·g-1，平均48.68 μg·g-1；在炒神曲中的范围为6.116～128.2 μg·g-1，平均51.08 μg·g-1；在焦神曲中的范围为25.91～162.3 μg·g-1，平均69.36 μg·g-1。就平均值来看，生品与炒神曲的平均含量基本一致，焦神曲中的含量与生、炒神曲有明显的升高。表1的结果显示，神曲的生、炒、焦制品中5-HMF的含量变化很大，即使是生品中的含量也从3.933 μg·g-1到163.6 μg·g-1，最大值是最小值的41.6倍，造成这种现象的原因，可能与神曲特殊的发酵制作过程有关。
2.3 色泽与5-HMF含量的相关性
生神曲、炒神曲两类的色泽基本一致，焦神曲的色泽明显加深。相对应的，5-HMF的平均含量在生神曲、炒神曲中基本一致，在焦神曲中明显升高。色泽与5-HMF含量之间具有完全对应的相关性。说明神曲在炮制过程中，随着温度的升高和时间的延长，引起色泽的加深和5-HMF含量的升高。
在19份神曲样品中，有7份来源于河北安国药材市场不同的经销商，有生、炒、焦之分，色泽不尽一致，5-HMF的含量也不一致，说明神曲的质量不统一。
3 结论
本实验首次在神曲及其不同炮制品中检测出了5-HMF。且随着生、炒、焦神曲的色泽加深，其中5-HMF的含量也显著升高。这种现象与何首乌[15]、黄精[16]炮制后引起色泽加深、5-HMF含量升高的现象一致。
就全国的情况来说，神曲的生产，不同地区所用原料及其配比不尽一致[17]，发酵过程中引入的微生物也不完全相同[18]，发酵时间等工艺参数也不一致[19]，这些因素势必导致神曲产品质量的不一致。因此，为了保证神曲的质量，应该建立全过程的质量控制系统，包括辣蓼、青蒿等原料的质量，保证各原料配伍比例的一致性，引入统一的神曲专用微生物，制定统一规范的发酵和炮制工艺，并从色泽等外观方面控制神曲产品的质量。只有这样，才能生产出统一质量的神曲，才可制定包括5-HMF在内的多个指标性成分的质量标准。
