COL4A5基因c.4518_c.4519 insC新突变所致X连锁显性遗传Alport综合征的分子遗传学及临床分析

周慧琴，徐达良，董 扬，江家云，伊世奇

Alport综合征(alport syndrome，AS)又称遗传性进行性肾炎，临床特点是以血尿、蛋白尿及进行性肾功能减退为主，部分病人可合并出现感音神经性耳聋、眼部异常、食管平滑肌瘤等肾外表现，是危及儿童及青少年生命健康的重要疾病之一[1-3]。随着精准医学的发展及各级医疗机构诊疗水平的提高,其发病率呈逐年上升趋势。根据2008年北美儿童肾脏实验及合作性研究中心的数据显示，AS患儿肾移植占同期儿童肾移植的2.3%,占同期儿童血液透析的2.3%,该病活产儿发病率为1∶5 000[4]。AS为编码Ⅳ型胶原α3、α4、α5链的基因突变所致，其中α3(Ⅳ)、α4(Ⅳ)基因突变所致为常染色体显性或隐性遗传，α5(Ⅳ)基因突变所致为X连锁显性遗传，至今为止已有超出700个基因突变被发现[5]。本研究采用高通量第2代测序技术对1例AS患儿进行检测，结果发现一个新的α5链位点移码突变，为国内外首次报道。

1 资料与方法

1.1 临床资料 患儿，女，3岁11个月，因“发现血尿、蛋白尿2年，水肿3 d，咳嗽1 d”于2018年12月就诊于安徽省儿童医院肾内科。患儿入院2年前(2016年12月)曾因“肺炎”在当地医院住院治疗时尿检发现隐血阳性，入院5个月前当地复诊复查尿检提示尿蛋白2+，隐血3+，血清白蛋白未见异常，24 h尿蛋白未见异常，当地医院诊断：血尿待查，IgA肾病可能，入院2个月前当地复查,尿蛋白弱阳性，红细胞计数849.9～1 274.7/μL；红细胞形态：非均一性红细胞；予以“黄葵胶囊”对症处理。患儿入院3 d前出现咳嗽及双眼睑水肿伴尿少，尿色呈浓茶色。病程中无皮疹，无关节肿痛。

入院查体：体温36.1 ℃,脉搏 110次/分，呼吸30次/分，体质量19.9 kg，血压108/60 mmHg,双眼睑水肿，咽部充血，双肺呼吸音粗糙，可闻及中粗湿啰音，心腹查体无特殊。诊断：肾病综合征(肾炎型)，给予积极抗感染治疗后肉眼血尿缓解。建议基因检查排除AS，送检第2代高通量测序(北京智因东方转化医学研究中心，北京全谱医学检验实验室)。患儿系母亲第1胎第1产，足月顺产出生，无窒息抢救史，胎盘及羊水无特殊，生长发育史无异常。父母非近期婚配，均体健。否认家族遗传病史及传染病接触史。我院实验室检查，尿常规：外观微混，颜色淡红，pH 5.5，尿蛋白3+，红细胞5 162/μL、929/HP、非均一性小细胞，24 h尿蛋白2.11 g/L；尿敏感肾功能六项：尿微量白蛋白1 582.40 mg/L，尿免疫球蛋白IgG 30.2 mg/L,N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶 13.50 U/L,4-尿转铁蛋白110.15 mg/L；生化：白蛋白25.9 g/L,尿素6.8 mmol/L，血肌酐38.7 μmol/L；血脂分析：总胆固醇5.81 mmol/L，钙2.15 mmol/L。肝功能正常，ASO 3.2 IU/mL,补体C3 1.6 g/L,补体C4 0.14 g/L,免疫球蛋白M 2.32 g/L,出凝血时间正常，清洁中段尿培养未见细菌，双肾B超示：右肾7.0 cm×3.5 cm，左肾6.9 cm×3.4 cm,双肾弥漫性病变。左肾静脉彩超未见异常，纯音测听听力无障碍，眼裂隙灯检查及视力检查未见异常，患儿父母及近三代尿常规未见异常。

入院后积极控制呼吸道感染予以头孢西丁抗感染，雾化化痰；添加缬沙坦27 mg每天1次，降蛋白对症治疗。患儿发病年龄小(1年11个月)，肾脏出现损害时间长(2年)，考虑遗传代谢病，需行肾活检和基因检测。与家长沟通后于2019年1月9日肾活检，结果提示基底膜厚薄不一，致密层增厚，部分呈撕裂状和蛛网状，建议进一步完善基因检测。2019年1月15日复查尿蛋白转阴，尿敏感肾功能六项：尿微量白蛋白30.39 mg/L，尿免疫球蛋白IgG 2.4 mg/L,N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶 10.16 U/L,4-尿转铁蛋白2.75 mg/L，初期未添加激素等免疫抑制剂，临床症状及辅检较前明显好转，目前予以缬沙坦27 mg每天1次及百令胶囊对症治疗。4个月后复诊，尿蛋白未见异常，肾功能正常，尿微量白蛋白30.00 mg/L，轻度升高。

1.2 病理研究方法 采用B超定位下经皮肾活检术，活检肾组织按常规方法进行光镜、免疫荧光和电镜检查，加做IV型胶原的检测。

1.3 DNA测序研究方法

1.3.1 基因组DNA提取 在患儿家长知情同意的前提下，采集病人及父母全血 2 mL(EDTA 抗凝血)进行基因分析。基因组 DNA 提取：取病人新鲜外周血，使用 BloodGen Midi Kit(CWBIO,China) 提取病人全基因组 DNA，操作按照试剂盒说明书进行。

1.3.2 全外显子组测序 采用 IDT 公司 xGen®Exome Research Panel v1.0捕获芯片。Cavoris仪打断至200 bp左右，片段化DNA 在 Klenow Fragment,T4 DNA polymerase 和T4PNK 的作用下进行末端补平修复。在聚合酶体系下，使上一步得到的修复产物在 3′末端加上 A 碱基，为下一步连接做好准备。配置T4DNA 连接酶反应体系，在Thermo mixer 中适温反应一定时间使 adapter 和加“A”产物连接。连接产物经4～6轮LM-PCR扩增。文库与探针混于杂交体系中 65 ℃、60～68 h杂交。使用链霉素磁珠，与杂交样本孵育后洗脱液洗脱。洗脱产物经10轮 LM-PCR 扩增。Illumina hiseq xten 平台标准化上机测序操作流程，测序得到图像原始数据，Illumina官方basecall分析软件BclToFastq得到原始数据(raw data)。去接头污染，去低质量的数据，数据与参考序列比对统计 (比对软件 BWA)，参考基因组： hg19基因组。SNP检测及注释：分析软件 samtools。Indel检测及注释：分析软件 pindel。变异假阳性过滤：根据测序深度，变异质量，对检测得到的SNP、Indel进行过滤筛选，得到高质量可靠的变异。变异注释：SNP和Indel根据在基因上的位置，分析得到氨基酸变化影响、剪切影响、UTR、内含子变异影响等。使用SIFT利用基于同源比对，蛋白结构的保守性等的算法，预测筛选出的变异对蛋白质的影响。对剪切位点附近的变异，做剪切危害性预测。

1.3.3 Sanger测序验证 根据COL4A5基因验证位点序列设计引物，应用PCR方法进行扩增。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，65 ℃退火30 s,72 ℃ 链延伸30 s，扩增30个循环。最后72 ℃补充延伸10 min。PCR的体系均为50 μL。用ABI 3730XL测序仪测序，测序引物采用原PCR引物。基因序列分析采用DNASTAR软件进行序列分析和比对，mRNA比对模板为 NM_033380。对点变异携带者病人及父母样本进行Sanger测序。

2 结果

2.1 肾活检结果 综合光镜、免疫及电镜结果回报：肾小球轻微病变伴个别新月体形成，C3系膜区沉积，可见19个肾小球，将荧光备片经PASM染色，可见12个肾小球，未见肾小球球性及节段性硬化。肾小球系膜细胞和基质轻微增生，无明显局灶节段性加重及内皮细胞增生，系膜区少许嗜复红蛋白沉积，毛细血管襻开放，荧光备片中1个细胞性新月体形成。肾小管上皮细胞空泡及颗粒变性，少数肾小管管腔扩张，刷毛缘消失，个别肾小管萎缩，肾间质轻度水肿，小灶状淋巴细胞及少许嗜酸性粒细胞浸润，小动脉管壁无明显病变(见图1)。免疫荧光：C3+球性系膜区呈颗粒状沉积；a3、a5肾小管基底膜节段表达(见图2)。超微结果：基底膜厚薄不一，基底膜致密层增厚，部分呈撕裂状和蛛网状，足突弥漫融合，少数系膜区可见少量电子致密物沉积(见图3)。

2.2 全外显子组测序及Sanger测序 全外显子组测序结果显示病人COL4A5基因49号外显子存在c.4 518_c.4 519 insC(p.Gln1 507Profs*14)的杂合变异，通过Sanger测序证实；该变异为第48号外显子上4 518和4 519位碱基中间插入了一个胞嘧啶，导致蛋白在第1 507位谷氨酰胺变异为脯氨酸后再编码14个密码子即终止编码，造成合成的蛋白出现截短，破坏了C末端的非胶原结构域NC1(见图4)。另该变异在dbSNP、Hapmap、千人基因组(1000 Genomes)、ExAC、gnomAD等数据库分布频率均为0。根据《ACMG遗传变异分类标准与指南》[6]的变异致病证据分级，病人携带的该变异满足PV1+PS1+PM2的致病证据，达到致病性变异(Pathogenic)级别。同时也未检测到病人其他肾炎相关基因的可疑致病变异。病人父母均不携带该变异，在该变异位置均为野生型，验证结果与目标序列捕获测序一致。

3 讨论

AS是目前导致儿童终末期肾病(ESRD)的重要疾病之一[3]。由于遗传性疾病现阶段进展至ESRD的治疗方法有限，过程无法逆转，因此儿科医生应高度关注，指导先证者家庭优生优育，降低患病儿童出生率，大大减轻家庭的负担。

本例全外显子组测序结果显示病人COL4A5基因49号外显子存在c.4518_c.4519 insC(p.Gln1507Profs*14)的杂合变异，通过Sanger测序证实。变异造成NC结构域的缺陷可能会引起Ⅳ型胶原蛋白质网络异常，致使基底膜不能分离和支撑许多组织中的细胞行为而发病，详细的致病机制需要进一步的体外实验来探究。WANG等[7]发现COL4A5基因移码变异导致的X连锁AS的一个大家庭，且该家庭的任何病人都没有眼睛或听力异常，仅仅有肾脏病变，没有肾外病变，与本例病人情况类似。本例病人父母该变异均为野生型，也符合孟德尔遗传规律。经检索Human Gene Mutation Database、Clinical Genome Resource、Pubmed和万方、知网等数据库，均未收录COL4A5基因的该变异，为未见报道的新的变异，该先证者基因位点为首次报道新位点，丰富了目前COL4A5基因移码突变谱及表型信息。

COL4A5基因突变位点与临床表现严重程度分为3类：严重型(S型)、中度-重度严重型(M-S型)和中度型(M型)。S型青少年期起病，年龄在20岁以下，80%患儿伴有听力异常，40%患儿伴有视觉异常，为大片段重组或者提前终止翻译或者移框突变或者N端序列突变等。M-S型在26岁前进展至ESRD，肾外系统受累较少，主要基因异常在21～47号外显子区发生甘氨酸替代突变，非甘氨酸错义突变和框内或受体剪切位点突变等。M型则在1～20号外显子区，在30岁后进展至ESRD，70%病人伴有听力丧失，最多30%病人伴有眼部病变。结合本例先证者移码突变位于第48号外显子上，患儿发病年龄早(1岁11个月)，临床表现肾脏损害严重(肾病综合征合并肉眼血尿)，由于患儿年幼(3岁11月)，目前肾外受累不明显，考虑为S型。

有学者[8]建议对每一个AS家系均进行遗传型诊断，以利于对先证者进行预后评估和先证者及其家系进行遗传咨询。AS病人子代患病的概率是有规律可循的：女性病人与正常男性婚配，其子女各1/2发病；男性病人与正常女性婚配，女儿都是病人，儿子正常。常染色体隐性遗传性者：病人双亲无病；同胞中1/4发病，男女机会相等，病人发生在同一代；近亲婚配者发病风险大大增高。AS病人大多数于青壮年时期发展至ESRD，需要透析和肾移植治疗。因此对于AS这样一种预后差的遗传性肾脏病，早期、正确的诊断十分重要。

(致谢 北京智因东方转化医学研究中心王亚健老师在实验技术及基因分析方面的帮助)