LCA2型基因治疗临床试验研究进展

赵儒意，罗学廷，谭 薇

0引言

Leber先天性黑矇(LCA)是一种遗传性致盲性眼病，其特征是在幼年时期出现严重的视力丧失和视细胞的退行性变[1-2]。其中LCA2是由视网膜色素上皮特异性65kD蛋白基因(RPE65)突变引起，约占所有LCA的6%[3]。RPE65在视网膜色素上皮细胞中表达并编码65kD蛋白质，该蛋白质是视循环的关键组分[4]，缺乏功能性RPE65将导致11-顺式视黄醛缺乏，使得视杆细胞不能产生光化学反应。早期视锥细胞可通过替代途径获得11-顺式-视黄醛[4-5]，故患有LCA的患者早期可依靠视锥细胞代偿获得视力，但随着视锥细胞的进行性退化最终也会导致视功能的丧失。

在动物模型基因治疗的安全性、有效性被证实的基础上[6-9]，费城儿童医院(CHOP)、伦敦大学学院(UCL)、佛罗里达大学(UF)三个研究团队分别对RPE65突变患者开展了基因治疗临床试验，治疗均采用将携带有野生型RPE65序列的载体注射于视网膜下，研究方案的区别主要在于载体设计、注射体积、部位和结果测量方法，在3个团队的Ⅰ～Ⅱ期研究中均显示了RPE65基因治疗的有效性。并且由CHOP研究团队进行的一项具有里程碑意义的Ⅲ期试验显示基因治疗后患者的multi-luminance mobility testing(MLMT)和光敏感度阈值得到改善[10]，而该治疗药物也于2017年获得了美国FDA批准用于RPE65突变的患者，这是第一个被批准运用于人眼的基因产品(Voretigeneneparvovec，Luxturna)；上述结果表明人类LCA2基因治疗已经趋于成熟。然而3个团队治疗效果的差异性表明LCA2基因治疗进入临床仍有很多问题有待解决，本综述对上诉LCA2基因治疗的临床试验进行了回顾，着重对基因治疗的注射剂型、剂量、注射方式、治疗效果与年龄的相关性和治疗效果的稳定性长期性等进行概述及讨论，以对LCA2基因治疗进入我国临床治疗提供更多的参考和治疗经验。

表1 三组中AAV2/2.RPE65的载体设计

1 LCA临床试验相关总结

1.1剂型在3个团队的研究中，所用载体均为AAV2，为了提高基因转导效率，研究人员在病毒载体与目的基因装配上进行了一些修改(表1)。UCL团队在目的基因前插入了RPE65特异启动子[11-12]，其主要针对RPE细胞进行表达。其他两个团队用的是CBA启动子[13-14]。但没有相应的并列实验来比较其人体试验中转导、转录、翻译强度或免疫反应性等。

1.2剂量效应与剂量毒性在Ⅰ期治疗成功的基础上[11,13-14]，3个团队分别进行了剂量递增试验以探索不同剂量下的疗效性与毒性。UF团队进行的两项研中，一项研究将15例患者分为5个剂量组[15]，另一项研究将12例患者分为低剂量和高剂量2组[16]。CHOP团队将12例患者分为低剂量、中等剂量和高剂量3组[17]。两个团队的研究均未显示出明显的剂量效应和剂量毒性[15-17]。UCL团队的研究将12例患者分为低剂量和高剂量2组，在该研究中高剂量组同样未显示出更好的视网膜功能改善，但和上诉研究不同高剂量组中有5例患者发生了轻度的眼内炎或免疫反应，1例患者发生了轻度葡萄膜炎[12]。

由上可见更高的剂量并不能带来更好的视网膜功能改善，虽然治疗效果还与载体浓度、注射方式、突变类型、患者年龄和视网膜变性的程度等有关。并且在高剂量条件下出现的毒性作用提示应该通过提高载体转染效率来更安全地提供RPE65，但除此之外还需要更多的研究以确定基因治疗载体的长期表达是否发挥剂量依赖性毒性或不良反应，以及如何在最大化治疗效果下达到最小化毒性风险。

1.3注射方式目前LCA2基因治疗采用视网膜下注射的方式递送载体，注射方式的不同主要是涉及注射部位以及视网膜下囊泡覆盖的位置。在3个Ⅰ期试验中[11,13-14]，9例患者有6例的视网膜下囊泡覆盖了黄斑区，其中2例患者的注射部位靠近中心凹附近(距离中心凹1～1.5mm范围内)，这6例患者有4例的视网膜功能得到不同程度的改善，但注射部位靠近中心凹的这2例患者，1例患者发生了黄斑裂孔[13]，1例患者的黄斑中心凹厚度变薄[14]。随后的Ⅰ～Ⅱ期试验中共有51例参与者[12,15-17]，其中有29例的视网膜下囊泡覆盖了黄斑区，多数患者表现出视网膜功能的改善，但也有患者出现视力下降[12,16]；且在UF团队的研究中治疗后视力增加的4例儿童有3例的视网膜下囊泡并未覆盖黄斑区[16]。

在既往研究中视网膜敏感性改善部位几乎都是与囊泡的位置所对应的[11,13,15-19]，但视力改善是否与注射位于中心凹或覆盖中心凹有关尚不明确。目前对于视网膜下注射是否能位于中心凹仍然有争议，在一些实验中显示了支持的数据[20-22]，但对于本身视力较低的患者中心凹附近的注射在多个临床研究中出现了不良事件[12-15,17,23]，并且即使在正常视网膜中，脱离的中心凹视网膜解剖复位后，中心凹视力也不能完全恢复[24-25]。对此有学者提出了一些改进方案：如注射部位可位于有功能受限但具有活力的视网膜区域进行[18]，或增加注射次数以便在既定剂量下达到最大化治疗面积[26]。

基因治疗的患者通常是年轻的，有晶状体的，没有玻璃体后脱离的，如何避免基因治疗中视网膜下注射导致的并发症，如晶状体损伤、白内障加速发展、术中玻璃体皮质切除不净导致的视网膜牵拉或其他玻璃体视网膜交界面的异常等。这些都是日后LCA2基因治疗需要考虑的因素，此外还需考虑术中注入空气对结果的影响，视网膜下囊泡的精确轨迹，以及由退行性变长期影响的中心凹光感受器和RPE的脆弱程度。

1.4测量方法Ⅰ期试验中，CHOP团队使用的测量方法包括：视力、Goldmann视野、移动性测试、瞳孔光反射、眼球震颤和OCT[13]。UCL团队使用的测量方法包括：视力、对比敏感度、色觉、视锥闪烁灵敏度、视野(微视野、Goldmann视野、明适应及暗适应自动静态视野)、移动性测试、OCT和视网膜电图[11]。UF团队使用的测量方法包括：视力、OCT、全视野敏感性测试(FST)-蓝光[14]。除此之外该团队还进行了标准暗适应及延长暗适应的光敏感度变化检测来评估治疗对视循环的影响[18]。这些测量方法都反映了基因治疗的有效性，但对于系统的评价仍较欠缺，在随后的研究中各团队逐步对其评价方法进行了完善。UCL团队后续增加了光谱灵敏度检测[12]。UF团队增加了视野(Goldmann动态视野、暗适应静态视野)、移动性测试、瞳孔光反射、固视检测和FST-红光检测[15]。并且还着重对视力、视敏度改善范围、OCT中外核层的厚度进行跟踪随访[27]。相比全视网膜厚度、外核层厚度能更清楚地显示光感受器变性的程度。CHOP团队随后增加了FST-白光和视网膜电图检测[17]。并且在后续I期试验中还同时进行了白光、蓝光以及红光的FST检测来显示视杆和视锥光感受器灵敏度，另外还进行了功能性MRI(fMRI)来反映视皮质的激活变化[19]。在最后的Ⅲ期试验进一步增加了静态视野检测，并且还开发了一种新的移动性测试方法(MLMT)以量化参与者在不同照明环境中绕过障碍物的能力[10]。

LCA2是一种视网膜退行性疾病，发病最初表示为功能性的受损随后出现结构性的破坏[28]，并且不同的光感受器受损程度不同，不同的疾病阶段对不同的检测方法敏感性也不同。在目前检测方法中结构性检测主要是OCT，其他检测主要是功能性的检测。如何对不同患者的治疗效果进行规范、客观、准确、长期、高效以及有针对性的评价也应该纳入日后人们进行研究的范围内。

1.5治疗效果的年龄/病程依赖性虽然在一些动物研究中显示，治疗在病程的早期和晚期都可能有效[29-31]，但是在基因治疗进入人体试验后结果却并非那么可喜，虽然有研究显示治疗效果并不与年龄成正相关[12,15]，但更多的研究显示年轻的患者治疗效果更好[16-17,19]。这种年龄与治疗效果之间的关系在一项研究年龄对病毒载体转导效率影响的研究中得到部分解释[32]。除此之外，疾病的进展也影响平均转导效率[33]，然而年龄大小不能完全代表疾病的严重程度[28]，因此可能需要进一步研究疾病的最佳治疗状态，并制定个性化的治疗方案。

1.6治疗效果的长期性和稳定性在最初的Ⅰ/Ⅱ期试验显示治疗有效[15,17,23,34]的基础上，三个团队分别进行了长期随访研究。CHOP团队进行的试验显示其改善的视网膜敏感性可持续至第3a，研究者推测可能是由于该试验中使用了更强的启动子[19]。而UCL和UF团队的研究显示视网膜敏感性的改善在治疗1～3a后均逐渐下降[12,27]，且多项研究显示视网膜变性仍在继续[12,27,35-36]。

治疗效果的有效性和长期性是包括LCA2在内的眼部疾病基因治疗的主要问题。人类试验中治疗效果不能长期维持的原因可能如下：(1)低效的转导：对此可能需要更高水平的RPE65，或在疾病后期进行维持治疗[9]。(2)介入治疗时的疾病状态[36-37]；最近一项研究显示下调糖酵解酶的转录抑制因子(sirt6)可挽救PDE6突变的视网膜色素变性患者的视杆细胞，表明基因治疗联合抑制细胞凋亡的途径可能延长治疗的有效期[38]，但这只能缓解疾病的发展对于疾病晚期光遗传学[39]或干细胞移植[40-41]可能更有效。(3)靶细胞存在非细胞自主死亡[42-43]，为此基因治疗可能需同时联合神经保护性治疗[42,44]或药物干预措施[45-46]。

2展望

虽然目前LCA2的基因治疗取得了巨大的成功，但随着LCA基因治疗进入临床阶段，如何规范化地进行基因治疗是需要立即解决的问题，并且由于LCA患者其年龄、RPE细胞、感光细胞变性的区域、程度及进展不尽相同，如何针对不同患者进行个性化的基因治疗，如注射部位与黄斑中心凹之间的关系、如何根据患者不同的疾病阶段将基因治疗联合不同的辅助治疗如神经保护治疗、抗细胞凋亡、细胞移植以及如何进行高效的系统性评价等是需要进一步深入研究的课题。