miR-526b在胰腺癌中的表达及作用

杨洋，鲍媛，吴新华，朱岭，刘杨安

（1.华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院 网络医疗部，湖北 武汉 430014；2.华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院后湖院区 肝胆胰外科，湖北 武汉 430021）

胰腺癌是致死率极高的恶性肿瘤，病死率预计将在2030年位居西方国家所有恶性肿瘤的第二位[1-2]。中国男性胰腺癌年发病率从2000年的约6/10万上升到2011年的约7/10万，相应的病死率从约7/10万上升到约8/10万[3]。胰腺癌确诊时大多已属晚期，手术切除率仅10%～20%，预后较差[4]。早期诊断困难、易转移和多药耐药性是导致预后不良的重要原因[5-6]。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类长约22个核苷酸的非编码RNA[7]。miRNA异常表达与肿瘤进展密切相关[8-9]。miRNA可与信使RNA 的3'非翻译区（3'-U T R）结合而抑制基因转录后表达[10]。miR-526b是最新鉴定的miRNA，在神经胶质瘤[11]和乳腺癌[12]中下调表达，发挥肿瘤抑制作用。尽管如此，胰腺癌中miR-526b表达水平及功能尚未见报道。本研究探讨miR-526b在胰腺癌中的表达，并探讨其作用。

1 材料与方法

1.1 组织样本收集

收集2013年1月—2015年1月间在华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院肝胆胰外科收治的52例胰腺癌患者临床病理标本。纳入标准：⑴ 经病理诊断为胰腺癌且行手术治疗的患者；⑵ 患者具有完整的临床及随访资料。排除标准：临床或病理资料不全者。患者术后立即将胰腺癌和癌旁组织冻存于-80 ℃冰箱。医院伦理委员会同意并批准该研究实施。

1.2 细胞及主要试剂和仪器

人胰腺癌细胞系（BxPC-3、SW1990、PANC-1 和As PC-1）和胰腺导管上皮细胞系（HPDE6-C7）购自美国ATCC细胞库。One Step Prime script miRNA cDNA合成试剂盒、细胞计数试剂盒-8（CCK8）、微孔板分光光度计、膜联蛋白V-荧光素异硫氰酸酯（FITC）/碘化丙啶（PI）检测试剂盒购于北京生物试剂有限公司。基质胶Matrigel及Transwell小室购于美国Invitrogen公司、miR-526b过表达序列miR-526b模拟物及下调表达序列miR-526b抑制物和阴性对照序列购自北京生物试剂有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养、转染和分组 将4 种胰腺癌细胞系和正常胰腺导管上皮细胞系置于有10% 胎牛血清的RPMI-1640 培养基，并在37 ℃和5%CO2下培养，取对数生长期且生长良好的细胞用于后续实验和转染。用lipofectamineTM2000 按说明书方案转染：其中包括上调miR-526b 表达的miR-526b模拟物、下调miR-526b 表达的miR-526b 抑制物和阴性对照序列分别转染AsPC-1 细胞，并分为miR-526b 模拟物组、miR-526b 抑制物组和空白对照组，通过qRT-PCR 检测转染效率。

1.3.2 qRT-PCR 按RNA 提取说明书步骤提取组织总RNA 后，测定总RNA 浓度，再依据逆转录试剂盒说明书行逆转录反应，生成cDNA，XRCC5 和miR-526b 引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成。XRCC5 上游引物：ACA TCG GCA TGA TGG CAG AA； 下游引物：TCA CAA AAG GCG GGA CCA C；miR-526b 上游引物：ACATCGGCATGATGGCAGAA；下游引物：TCA CAA AAG GCG GGA CCAC，GAPDH 上游引物：GTA ACC CGT TGA ACC CCA TT；下游引物为：CCA TCC AAT CGG TAG TAG CG，其中GAPDH为内参，结果分析采用2-ΔΔCT法定量。

1.3.3 细胞侵袭试验 将1×105/100 μL 细胞悬液接种到上室，按1:8 比例对50 mg/L 的Matrigel稀释后，将Transwell 小室底部膜包被。DMEM 培养液500 μL 加于小室的下室，48 h 后取出小室，采用4% 多聚甲醛固定细胞，时间15 min，采用结晶紫染色，染色时长10 min，PBS 漂洗后200 倍视野下镜检并计数侵袭细胞数目。

1.3.4 细胞增殖和凋亡实验 用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）测定细胞增殖。将96 孔板用转染的细胞（5×103细胞/ 孔）接种96 h，每24 h，每孔接受10 μL CCK-8 溶液孵育4 h。然后用微孔板分光光度计在每个时间点测量450 nm 处的吸光度。流式细胞术使用膜联蛋白V- 荧光素异硫氰酸酯（FITC）/ 碘化丙啶（PI）检测试剂盒评估凋亡程度。将总共约5×104AsPC-1 细胞接种到6 孔板中用于细胞凋亡测定，使用膜联蛋白V-FITC 凋亡检测试剂盒,按说明书进行染色程序，使用Cell-Quest 软件分析细胞凋亡率。

1.3.5 荧光素酶报告基因测定 将含有预测miR-526b 结合位点的X- 射线修复交叉互补蛋白5（X-ray repair cross-complementing protein 5，XRCC5）突变型3'UTR 和XRCC5野生型3'UTR 插入pmiRGLO 载体（Promega，美国）中。将AsPC-1细胞接种于96 孔板中，用XRCC5 野生型3'UTR或XRCC5 突变体3'UTR 荧光素酶报告基因和阴性对照序列或miR-526b 模拟物与Lipofectamine 2000 共转染。在转染48 h 后，采用双荧光素酶报告系统检测荧光素酶活性并以海肾活性标准化。

1.3.6 Western blot 分析 使用RIPA 缓冲液提取转染细胞的总蛋白质。用10%-12%SDS-PAGE 凝胶分离蛋白质并转移到硝酸纤维素膜上。随后，用5% 无脂牛奶封闭2 h，并与包括XRCC5（Santa Cruz，美国）和GAPDH（Santa Cruz，美国）一抗孵育。在4 ℃下过夜。根据制造商的说明，用ECL 试剂盒（Beyotime，南京）检测蛋白印迹。

1.4 统计学处理

用SPSS 19.0 统计学软件对数据行统计分析。计量数据以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。胰腺癌组织中miR-526b表达水平与患者临床病理参数采用卡方检验；Kaplan-Meier生存分析和对数秩检验比较miR-526b高低表达患者生存率差异；胰腺癌组织中miR-526b和XRCC5mRNA表达间关系采用Pearson相关性分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 miR-526b 在胰腺癌中表达水平下调

胰腺癌组织中miR-526b 表达量明显低于癌旁组织[（3.2±1.3）vs.（8.5±2.6），P＜0.001]（图1A）；4种胰腺癌细胞系（BxPC-3、SW1990、PANC-1和AsPC-1）中miR-526b表达水平均明显低于人正常胰腺导管上皮细胞系HPDE6-C7（均P＜0.001）（图1B）。

2.2 转染效果检测

与对阴性照组比较，AsPC-1细胞转染miR-526b 模拟物后，miR-526b 表达水平明显升高（P＜0.01），而转染miR-526b抑制物后，miR-526b表达水平明显降低（P＜0.01）（图2）。

2.3 miR-526b 对胰腺癌细胞增殖的影响

CCK8结果显示，miR-526b模拟物组增殖能力明显低于阴性对照组（P＜0.01）；miR-526b抑制物组增殖能力明显高于阴性对照组（P＜0.01）（图3）。

图1 qRT-PCR 检测miR-526b 表达 Figure 1 Expressions of imiR-526b detected by qRT-PCR and normal pancreatic ductal epithelial cells

图2 miR-526b 转染效率测定Figure 2 Determination of the transfection efficiency of miR-526b

2.4 miR-526b 对胰腺癌细胞凋亡的影响

流式细胞检测结果显示，miR-526b模拟物组凋亡率明显高于阴性对照组[（15.1±2.4）% vs.（8.2± 0.7）%，P＜0.05]；miR-526b抑制物组细胞凋亡率明显低于阴性对照组[（4.6±0.4）% vs.（8.2± 0.7）%，P＜0.05]（图4）。

图4 miR-526b 表达对胰腺癌细胞凋亡的影响 Figure 4 Infl uence of miR-526b expression on apoptosis of pancreatic cancer cells

2.5 miR-526b 对胰腺癌细胞侵袭的影响

Trans well结果显示（200 倍视野下），miR-526b模拟物组侵袭细胞 数明显少于阴性对照组[（40±5）个vs.（70±12）个，P＜0.01]；miR-526b inhibitor 组侵袭细胞数明显多于阴性对照组[（215±26）个vs.（70±12个），P＜0.01]（图5）。

图5 miR-526b 表达对胰腺癌细胞侵袭的影响 Figure 5 Infl uence of miR-526b expression on invasion of pancreatic cancer cells

2.6 miR-526b 上调抑制XRCC5 的表达

检索miRanda数据库（www.miroRNA.org）发现XRCC5是miR-526b潜在靶基因。miR-526b模拟物和XRCC5 野生型3'UTR（XRCC5-WT-3'UTR）共转染，荧光素酶报告基因活性显著性降低，miR-526b模拟物和突变型XRCC5的3'UTR（XRCC5-MUT的3'UTR）共转染后，荧光素酶报告基因活性无改变。进一步研究显示，当AsPC-1细胞转染miR-526b模拟物后，细胞系中XRCC5的mRNA和蛋白质表达均较空白对照组（转染阴性对照组序列）明显下调（均P＜0.05），当AsPC-1细胞转染miR-526b抑制物后，XRCC5的mRNA和蛋白质表达均较空白对照组明显上调（均P＜0.05）（图6）。

2.7 胰腺癌组织中miR-526b 和XRCC5 mRNA表达的相关性

Pearson相关显示：胰腺癌组织中miR-526b 和XRCC5mRNA 表达水平呈显著负相关（r=-0.456,P＜0.001）（图7）。

图6 miR-526b 靶基因分析Figure 6 Analysis of the target gene for miR-526b

图7 胰腺癌组织中miR-526b 和XRCC5 mRNA 表达的相关性Figure 7 Correlation between the expression of miR-526b and XRCC5 mRNA in pancreatic cancer tissue

3 讨 论

胰腺癌是常见的高致死性肿瘤[13]。胰腺癌诊断时常处于晚期，即胰腺癌切除术后5年生存率仍低于20%[14-15]。研究胰腺癌的发病机制对改善胰腺癌预后尤为重要[16]。

本研究发现在胰腺癌患者病理标本中，癌组织中miR-526b表达显著低于癌旁组织；4种胰腺癌细胞系中miR-526b表达均较胰腺正常导管上皮细胞系下调，显示miR-526b在胰腺癌组织和细胞系中表达下调，此结果与目前文献报道存在一致性：文献[17]报道在非小细胞肺癌患者中，无论病理类型是鳞状细胞癌还是腺癌，手术切除病理标本中均可发现癌组织miR-526b表达水平显著低于癌旁组织，同时在神经胶质瘤[11]、乳腺癌[12]和结肠癌[18]患者中，癌组织中miR-526b表达水平也低于癌旁组织，综合上述结果提示在多种不同类型的癌症中均可发现癌组织中miR-526b表达水平受到抑制。

miR-526b在其他肿瘤中的表达及与预后的关系已有相关报道。在肝细胞癌中，癌组织中miR-526b低表达与低分化、TNM分期、转移和门静脉癌栓相关，且是影响预后的独立危险因素[19]；在宫颈癌体外细胞实验中，miR-526b 低表达可促进宫颈癌细胞的上皮间质转化过程而发挥促癌作用[20]。在体外胰腺癌细胞系AsPC-1中，通过上调miR-526b表达后，发现AsPC-1细胞增殖和侵袭能力受到明显抑制，细胞凋亡比率显著增加；而下调miR-526b表达后发现AsPC-1细胞增殖和侵袭能力显著增强，细胞凋亡比率显著下降，提示miR-526b表达可影响胰腺癌细胞增殖、侵袭和凋亡。

XRCC5是参与DNA双链断裂（DNA doublestrand breaks，DSBs）修复的主要基因，可编码Ku80 蛋白[21]。在细胞生命活动中，错误修复的DSB是主要的DNA损伤，可导致染色体畸变、突变或癌变，是各种癌症发生的重要机制之一[22]。临床研究已经证实XRCC5是重要的癌基因之一，XRCC5高表达导致Ku80蛋白过表达，Ku80蛋白高表达与膀胱癌[23]、宫颈癌[24]和结肠癌肝转移[25]进展呈正相关，XRCC5高表达是上述癌症发生和进展的重要因素。在结直肠癌肝转移的患者中，癌组织中XRCC5高表达与淋巴结和肝转移显著相关[25]；在乳腺癌中研究者也发现XRCC5高表达是预测患者接受放射治疗后不良预后的独立危险因素[26]。通过生物信息检索和双荧光素酶报告基因结果显示XRCC5是miR-526b潜在靶基因，同时文献[17]报道在非小细胞肺癌中也证实miR-526b靶基因为XRCC5，且miR-526b低表达直接靶向调节XRCC5基因高表达而促进NSCLC进展。

本研究结果显示，在胰腺癌细胞系（AsPC-1）中，miR-526b表达可调节XRCC5基因表达；且在胰腺癌患者病理标本中发现胰腺癌组织中miR-526b表达与XRCC5 mRNA表达呈负相关。在非小细胞肺癌细胞系A5490中，miR-526b上调可导致XRCC5基因表达水平降低、p53基因表达水平增加且促进A549细胞凋亡[17]；同时在肺腺癌中miR-526b 可能调节XRCC5基因表达而影响肺腺癌患者化疗敏感性[27]；结合本研究结果，提示miR-526b可能通过调节XRCC5基因表达而影响胰腺癌细胞增殖、侵袭和凋亡。

本研究存在如下不足：本研究并未在动物实验中探讨miR-526b和XRCC5表达变化对肿瘤进展的影响，值得进一步探究。

总之，胰腺癌患者miR-526b 表达下调，miR-526b 下调表达促进癌细胞增殖、侵袭并抑制凋亡，机制可能与上调XRCC5 表达有关。