莪术醇对子宫内膜异位症模型大鼠炎症因子的影响

2019-10-11聂晓博马怡坤赵娜胡彬刘姣刘晓兰

天津医药 2019年9期

聂晓博，马怡坤，赵娜，胡彬，刘姣，刘晓兰△

子宫内膜异位症（endometriosis，EMS）是一种常见的妇科慢性疾病，发病率约占所有育龄期妇女的10%［1-2］。该病因发病率高，对患者的工作、学习和生活影响大而引起广泛关注。虽然EMS 已成为一个日益严重的社会健康问题，但至今仍缺乏明确的诊断生物标志物和更有效的治疗方法［3］。现代研究已证实，腹腔微环境中慢性炎症的长期存在可诱导免疫抑制，并促进疾病进展。抗炎和（或）免疫调节也成为治疗本病的新方向。莪术醇又名姜黄环奥醇，为临床治疗EMS常用中药莪术中的主要有效成分，现代研究发现其具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎等作用。本研究通过观察莪术醇的抗EMS作用，从抑制炎症因子角度对可能的作用机制进行探讨。

1 资料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 SD 大鼠，SPF 级，雌性，体质量180～200 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物使用许可证：SYXK（冀）2016-0047。饲养于独立通风笼盒中，恒温恒湿，喂饲灭菌大鼠饲料，饮用重蒸水。

1.1.2 主要试剂及仪器莪术醇（CAS：4871970），纯度≥98%购自上海吉至生化科技有限公司；戊酸雌二醇（1 mg/片，批号：433A）购自德国拜耳；头孢呋辛钠（1.5 g/瓶，批号：18101601）购自深圳立健药业有限公司；巨噬细胞趋化蛋白-1（MCP-1）试剂盒（货号：SXR043）购自上海森雄科技实业有限公司；巨噬细胞游走抑制因子（MIF）试剂盒（货号：SXR044）购自森雄科技实业有限公司；肿瘤坏死因子α（TNF-α）试剂盒（货号：C06PZB）、白细胞介素1β（IL-1β）试剂盒（货号：C09PDB）、白细胞介素6（IL-6）试剂盒（货号：C12PDB）购自北京北方生物技术研究所；羊抗兔TNF-α（货号：ab6671）多克隆抗体购自艾博抗有限公司；FGF-2 和GAPDH 的PCR 引物购自生工生物工程（上海）股份有限公司；Trizol试剂（批号：K26LG）、SYBR Green Master Mix（批号：00684721）购自赛默飞世尔科技（美国）有限公司。C1000 Touch thermal cycler PCR 仪购自美国Bio-Rad 公司。酶标仪购自美国Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制备雌性SD大鼠适应性饲养3 d后，戊酸雌二醇（0.2 mg/kg体质量）灌胃，每日1次，连续3 d，使各组大鼠动情期趋于一致（进行阴道涂片，可见大量无核角化细胞）。末次给戊酸雌二醇后禁食12 h，腹腔注射水合氯醛麻醉，备皮后开腹，结扎并剪取大鼠左侧子宫约0.5 cm，将子宫于无菌生理盐水中纵向剪开，以可吸收手术丝线订于腹壁上（内膜贴向腹壁），关腹。术后腹腔注射头孢呋辛钠抗感染，每日1次，连续5 d。4周后，大鼠麻醉再次开腹，观察子宫内膜移植部位，若见到内膜生长为透明囊泡，内有液体积聚，则为造模成功。另设假手术组，仅开腹后剪去子宫周围脂肪组织，关腹。

1.2.2 分组及给药将造模成功的大鼠利用随机数字表随机分为2组，分别为模型组及莪术醇组，每组10 只。另设假手术组大鼠10 只。各组大鼠每日灌胃给药（或蒸馏水）10 mL/kg，连续4周。

1.3 指标检测末次给药后，大鼠禁食12 h，麻醉后开腹，以1 mL蒸馏水冲洗腹腔并收集清洗液。剪取EMS大鼠的异位内膜组织，假手术组大鼠的正常在位子宫组织，部分组织以4%甲醛固定，石蜡包埋，切片后HE染色；剩余组织-80 ℃冻存。

1.3.1 腹腔液中MCP-1、MIF、TNF-α、IL-1β 及IL-6 含量检测以ELISA法检测腹腔液中MCP-1和MIF含量；放免法检测腹腔液中TNF-α、IL-1β和IL-6含量。

1.3.2 免疫组织化学染色法检测异位内膜组织中TNF-α 表达取包埋异位内膜组织的蜡块，切片，65 ℃烤片，以二甲苯、乙醇梯度脱蜡，水洗，山羊血清封闭15 min，滴加一抗，4 ℃过夜，滴加二抗，显色，封片后显微镜下观察，以出现明显棕色或黄色颗粒为阳性信号。利用Image J 软件对显微镜下图片的阳性信号进行分析。

1.3.3 Real-time PCR 检测内膜组织中FGF-2 mRNA 水平分别取100 mg 左右的异位内膜组织或子宫组织，加入Trizol RNA-solv Reagent 匀浆，取上清，采用Trizol 法提取总RNA，测定提取液中RNA浓度。以M-MLV 逆转录酶进行逆转录后得到cDNA，加入下列引物。FGF-2 引物序列：上游5´- CGAACCGGTACCTGGCTATG - 3´ ，下游5´- ACTGCCCAGTTCGTTTCAGT-3´，扩增片段长度162 bp。GAPDH引物序列：上游5´-AGGAAATGATGACCTCCTGA-3´，下游5´-CAGGCATTGTCTGAGAGGCA-3´，扩增片段长度605 bp。在荧光定量PCR仪中进行扩增。PCR扩增条件：50 ℃2 min；95 ℃2 min，95 ℃15 s，60 ℃15 s，72 ℃1 min，循环40次。计算2-ΔΔCt值，表示组织中FGF-2 mRNA的相对表达量。

1.4 统计学方法采用SPSS 23.0分析数据，结果采用±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 内膜组织的病理观察结果显示，假手术组大鼠在位子宫内膜为单层柱状上皮（箭头所示），排列整齐，形态完整（图1A）。模型组大鼠异位内膜形态与在位子宫内膜相似，也呈柱状整齐排列（箭头所示），异位病灶囊泡内有中性粒细胞集聚，周围组织中血管较为丰富（图1B）。莪术醇组大鼠异位内膜剥脱，未见柱状上皮细胞（图1C）。

2.2 腹腔液中MCP-1、MIF、TNF-α、IL-1β 和IL-6含量比较结果显示，与假手术组相比，模型组和莪术醇组大鼠腹腔液中MCP-1、MIF、IL-1β和IL-6含量均显著升高（P＜0.05），模型组大鼠腹腔液中TNF-α含量也显著升高（P＜0.05）。与模型组相比，莪术醇组大鼠腹腔液中MCP-1、MIF、TNF-α、IL-1β和IL-6含量均显著降低（P＜0.05），见表1。

Fig.1 Pathological observation of ectopic endometrium in rats(hematoxylin-eosin staining，×200)图1 内膜组织的病理观察（HE染色，×200）

Tab.1 Comparison of contents of MCP-1,MIF,TNF-α,IL-1β and IL-6 in abdominal fluid of rats between three groups表1 各组大鼠腹腔液中MCP-1、MIF、TNF-α、IL-1β和IL-6含量比较（n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a与假手术组比较，b与模型组比较，P＜0.05

组别假手术组模型组莪术醇组F MCP-1（ng/L）320.426±57.031 1 166.426±258.312a 666.602±370.753ab 24.984＊＊MIF（μg/L）92.966±18.752 132.670±8.985a 107.950±13.357ab 20.847＊＊TNF-α（μg/L）0.907±0.195 1.307±0.317a 0.958±0.157b 7.560＊＊IL-1β（μg/L）0.148±0.005 0.198±0.017a 0.174±0.017ab 24.264＊＊IL-6（μg/L）89.939±10.044 109.703±4.065a 102.579±5.828ab 20.409＊＊

2.3 各组异位内膜组织中TNF-α 及FGF-2 mRNA表达比较结果显示，与假手术组大鼠在位子宫相比，模型组和莪术醇组大鼠异位内膜组织TNF-α及FGF-2 mRNA 表达均明显增强（P＜0.05）。与模型组相比，莪术醇组大鼠异位内膜组织TNF-α 及FGF-2 mRNA表达明显减弱（P＜0.05），见表2、图2。

Tab.2 Comparison of TNF-α and FGF-2 mRNA expression in endometrial tissues of rats between three groups表2 各组大鼠内膜组织中TNF-α和FGF-2 mRNA表达量比较（±s）

＊＊P＜0.01；a与假手术组比较，b与模型组比较，P＜0.05

组别假手术组模型组莪术醇组F n3 3 3 TNF-α 0.213±0.013 0.290±0.006a 0.250±0.013ab 36.722＊＊FGF-2 mRNA 1.039±0.410 5.249±0.772a 4.054±1.169ab 51.411＊＊

3 讨论

3.1 局部炎症反应在EMS 发病过程中的作用近年来，EMS的发病率逐年升高，因常伴有慢性盆腔疼痛、粘连和不孕，严重影响患者的生活质量和生殖能力，引起妇科界的广泛关注。本病虽已研究多年，但其作用机制仍然不清。目前已有许多关于发病机制的理论，其中最为人接受的是Sampson 的月经逆行理论［4］。Sampson认为，子宫内膜细胞在月经期间通过输卵管运输，植入腹膜表面，并异位种植、生长为病灶。大多数女性经期存在经血逆流，但仅有10%发展为EMS的原因值得深思。

现代研究发现，在EMS 发病的众多机制中，局部炎症反应和免疫异常可能发挥了重要作用［5］。多种证据表明，这些子宫内膜植入物促进慢性炎症局部微环境及全身免疫的改变，进而引起粘连、血管生成和增殖的发生［6-8］。腹水中的免疫细胞由巨噬细胞、淋巴细胞和肥大细胞组成［2］。巨噬细胞是先天免疫系统中的主要免疫细胞，是EMS局部炎症反应的关键细胞，如MCP-1、FGF、纤溶酶原激活剂、黏附分子、细胞因子和环氧合酶的产生中发挥重要作用。其中，MCP-1 是单核吞噬细胞的化学引诱剂，由白细胞、巨噬细胞、正常子宫内膜组织和子宫内膜异位组织分泌。MCP-1 结合趋化因子受体吸引单核细胞到靶组织，促进单核细胞从外周血向腹腔迁移，转化为巨噬细胞，并分泌多种炎性细胞因子，导致EMS常见的局部腹膜炎症［9］。在活化的巨噬细胞分泌的众多细胞因子中，TNF-α在EMS疾病进程中发挥着重要的作用，除进一步诱导其他炎性细胞因子的释放，促进病灶局部的炎性细胞浸润外，还是血管活性因子之一，诱导异位内膜细胞和基质细胞的增殖及血管新生。巨噬细胞所分泌的IL-1 和IL-6 均为机体炎症反应的重要介质，可以诱导T 淋巴细胞和B淋巴细胞的分化，具有免疫调节作用。其中IL-1家族细胞因子可能是导致EMS 患者腹腔免疫功能异常的因子。异常异位子宫内膜细胞黏附、种植和增殖的特性均与IL-1 水平异常升高有关。腹腔液中IL-6含量异常增多时，能增强单核细胞、自然杀伤细胞的功能，加剧腹腔粘连，促进了EMS 的发生发展［10］。

Fig.2 Expression of TNF-α in uterine tissues of rats in three groups(immunohistochemical staining,×200)图2 各组大鼠内膜组织中TNF-α表达情况（免疫组化染色，×200）

成纤维细胞生长因子家族（Fibroblast growth factors，FGFs）是一类多肽生长因子，在人体中发挥着多种功能，通过与其受体结合调控胚胎发育并促进多种器官修复。在FGFs 中，基础FGF 又称FGF-2，在炎症反应和血管新生、修复与再生过程中均发挥着重要作用。一方面，FGF-2 同样参与了对巨噬细胞的吸引，使巨噬细胞在异位病灶处聚集，在促使各种相关炎症因子和生长因子分泌的同时，又进一步刺激异位的子宫内膜细胞合成并释放FGF-2，加剧腹腔病灶局部的炎症反应。另一方面，FGF-2 还是一种血管再生的调控因子，尤其是在炎症反应过程中促进相关的病理血管生成。FGF-2通过刺激子宫内膜粘连、细胞增殖以及血管新生，参与EMS 的发生和发展［11］。

以上研究证实，慢性炎症及其诱导的免疫抑制在EMS 发生发展中发挥着重要作用。现代临床研究也证实，在EMS 患者腹腔局部微环境中FGF-2、MCP-1、MIF-2、IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量显著升高［3］。本研究采用自体子宫移植法复制大鼠EMS模型，发现腹腔液中MCP-1、MIF-2、IL-1β、IL-6 和TNF-α含量升高，同时异位子宫内膜组织中TNF-α表达和FGF-2 mRNA 表达水平均明显高于假手术组，这些异常与EMS患者的临床改变相一致。

3.2 莪术醇通过抑制炎症因子对EMS 的改善作用 EMS 不仅发病机制不清，临床也缺乏安全有效的治疗用药。西医多以激素类药物进行治疗，但此类药物存在不良反应，患者耐受性差。近年来，中药治疗EMS 因为疗效显著且不良反应轻微受到广泛关注。EMS 属中医痛经、不孕、癥瘕范畴，其病因多为瘀血阻滞，活血化瘀为常用治疗法则。莪术为常用活血化瘀药，善破血中之结，为临床治疗EMS 方剂中的主要药物。现代研究证实，莪术中主要活性成分莪术醇主要具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗血小板聚集、抗血栓形成等作用［12］。本课题组前期研究发现莪术提取液能通过抑制JAK2/STAT3 信号转导通路，拮抗EMS 的发展进程，甚至使异位内膜组织萎缩。笔者推测，莪术醇对EMS应该具有改善作用，但目前尚无文献报道。鉴于EMS、炎症和免疫之间的关系已被公认［13］，本研究从对炎症因子影响的角度对莪术醇治疗EMS 的效果及可能的机制进行探讨。本研究显示，莪术醇能使EMS模型大鼠腹腔液中MCP-1、MIF、TNF-α、IL-1β、IL-6 含量显著降低，显著下调异位内膜组织中TNF-α 表达和FGF-2 mRNA 表达，具有明显抑制腹腔微环境中炎症反应作用。