氟苯尼考纳米结晶的制备及其药剂学性质的考察

方宇奇 高崇凯 易军 李晓芳 吴芳 刘佳华 刘铄佳 陈钰轩 郭波红,*

(1 广东药科大学，药学院，广州 510006；2 广东润华药业有限公司，揭阳 515500)

氟苯尼考(flofenicol, FF，氟甲砜霉素)是美国先灵-宝雅(Schering-Plough)公司于70年代末研制的广谱兽用抗菌药[1]，对革兰阳性菌和革兰阴性菌均有作用，其抗菌机制与同类氯霉素和甲砜霉素相似，抗菌活性明显优于氯霉素[2]。但是氟苯尼考水溶性较低，机体吸收慢，且药物残留比重大，易产生耐药菌株[3]。针对氟苯尼考生物利用度低的问题，国内外科研工作者进行了大量的探索和研究。有学者[4]采用水溶液搅拌法制备氟苯尼考-β-环糊精包合物，水溶性提高了6.67倍，然而羟丙基-β-环糊精水中的溶解性有限并有溶血性，在实际应用中还有待开发。还有学者采用化学方法在氟苯尼考结构中引入亲水基团，将其制成无活性的前体药物进入动物体内代谢成原药发挥作用。另有文献报道[5]，采用磷酸化系统三氯氧磷(POCL3)/吡啶/乙腈(CH3CN)制成水溶性的氟苯尼考磷酸酯，并且进行了小规模的放大试验。此方法对于氟苯尼考的生物利用度有很大提高，但对产品合成要求高，所需试剂昂贵且不易得，对工业化生产有很大的限制。因此，有必要通过一定的技术手段，寻找和开发低成本的氟苯尼考制剂。

纳米结晶是采用少量表面活性剂或聚合物稳定的亚微米胶体分散体系，能显著提高难溶性药物的溶解度，改善药物的生物利用度，为解决难溶性药物制剂的制备问题提供了新思路和新方法[6-10]。因此，本实验通过微型化介质研磨法制备FF-NC并进行小规模的放大化制备，改善其溶解度和溶出速度，以期达到速释，高效的目的。

1 仪器与材料

1.1 仪器

DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市予华仪器责任有限公司)；KQ2200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；PRACTUM124-1CN电子天平(德国Sartorius科学仪器有限公司)；PHN Labstar 0.5CE纳米砂磨机(广东派勒智能纳米科技股份有限公司)；DelsaTMNano C 粒径分析仪(美国 Beckman Coulter公司)；PKZ-1电热恒温振荡水槽(上海精密实验设备有限公司)；Spectrum 100傅里叶红外光谱仪(美国PerkinElmer仪器有限公司)；Aglient 1200高效液相色谱仪(Aglient公司)；ESCALAB 250 X射线光电子能谱仪(美国赛默飞世尔科技有限公司)；SD-06AG喷雾干燥机(英国Labplant公司)。

1.2 试药

FF对照品(含量：99.90%，批号：K0301703，中国兽医药品监察所)；FF原粉(含量：99.50%，批号：18103-6，山东国邦药业股份有限公司)；氧化锆珠子(直径为0.2mm，湖南瑞辰陶瓷有限公司)；羟丙甲纤维素(HPMC E5，安徽山河药用辅料股份有限公司，批号：170808)；十二烷基硫酸钠(SDS，安徽山河药用辅料有限公司，批号：170901)；聚维酮K29/32(PovidoneK29/32，PVPK29/32，德国亚什兰公司，批号：25000240379)；泊洛沙姆188(Poloxamer 188，F68，巴斯夫中国有限公司，批号：F271527)；羧甲基纤维素钠(CMCNa，安徽山河药用辅料股份有限公司，批号：170901)；大豆卵磷脂(PC，上海源聚生物科技有限公司，批号：171013)；水为蒸馏水；甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂均为市售分析纯。

2 方法

2.1 FF含量测定

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Dikma C18(250mm×4.6mm, 5μm)，流动相：乙腈:水=35:65(V/V)，检测波长：224nm，柱温：30℃，进样量：20μL。

2.1.2 线性关系的考察

精密称取干燥至恒重的FF对照品5mg，置于10mL容量瓶中，用流动相溶解定容，得500μg/mL的标准贮备液。分别量取上述贮备液0.1、0.3、0.5、0.8和1.0mL于5mL容量瓶中，加入流动相稀释至刻度，摇匀，精密吸取20μL进行HPLC测定。以峰面积(A)对浓度(C, μg/mL)进行线性回归，得回归方程：A=41.211C+1.553(R2=0.9999)。说明FF在10～100μg/mL浓度范围内与峰面积线性关系良好。方法学考察表明：在本色谱条件下，高中低浓度的平均回收率为99.96%，RSD为0.52% (n=9)，日内精密度RSD=0.73%(n=6)，日间精密度RSD=0.27%(n=3)。

2.2 FF-NC的制备

参考文献[11]采用微型化介质研磨法制备FF-NC。称取15mg的FF原粉和适量的稳定剂置于10mL西林瓶中，加入3mL蒸馏水及18g直径为0.2mm的氧化锆珠子，将西林瓶置于磁力搅拌器上，照设定转速和时间进行研磨，除去氧化锆珠子，即得FF-NC。

2.3 FF-NC制备工艺单因素考察

2.3.1 稳定剂种类的考察

本研究选择常用的高分子聚合物PVPK29/32(A)、 HPMC E5(B)、CMC-Na(C)、表面活性剂F68(D)、PC(E)以及SDS(F)作为稳定剂来进行单一稳定剂的筛选，浓度均为0.1%。根据初步筛选结果，以表1进行实验安排，以粒径及多分散系数PDI为评价指标，进一步筛选出适合FF-NC的稳定剂组合。

2.3.2 研磨速度的考察

按“2.2”项下方法，将15mg FF原粉分散到3mL蒸馏水中(含HPMC及SDS各0.1%)，加入研磨介质(直径为0.2mm)研磨，考察不同研磨速度对FF-NC性质的影响。

2.3.3 研磨时间的考察

按“2.2”项下方法，称取15mg FF原粉及3mg稳定剂(以上述HPMC+SDS作为稳定剂)置于容积为10mL的西林瓶中，加入3mL蒸馏水，搅拌子及适量0.2mm氧化锆珠子，在900r/min转速下搅拌研磨，考察研磨时间对FF-NC性质的影响。

2.3.4 正交试验优化制备工艺

制剂制备的各处方工艺之间存在交互影响，在单因素考察的基础上，以A：稳定剂浓度(W/V, %)，B：转速(r/min)，C：研磨时间(h)3个因素进行正交试验设计，采用L9(34)正交表(表2)，以Span值[12]为综合考察指标，筛选出制备FF-NC的最优处方。

Span=(D90-D50)/D10

其中D90、D50和D10分别表示粒径分布中占90%、50%和10%的粒子所对应的粒径。Span值越小表示粒径分布越窄，粒子越均匀。

2.3.5 FF-NC制备工艺的验证

以粒径及PDI为指标，根据正交试验优化筛选出的最优处方及工艺条件重复制备3份FF-NC以验证工艺重现性。

表1 稳定剂的筛选Tab.1 The screening of stabilizers

表2 因素水平表 Tab.2 Factor and level of the experiments

2.3.6 FF-NC的固化

根据正交试验优化所得到的最优处方，采用PHN Labstar 0.5CE纳米砂磨机，将处方量等比例放大的稳定剂及FF原粉(投料量共100g)加至含2L水的搅拌室中，预搅拌30min使混合均匀。随后将混合后的物料泵入研磨腔中，研磨一定时间得到FF-NC，采用喷雾干燥固化得到FF-NC固体粉末(共得固体61.5g，收率为61.5%)，进行体外性质的考察。喷雾干燥条件为：进风温度195℃，出风温度84℃，进液速度为7.0mL/min，风量为0.5m3/min。

2.4 FF-NC的体外评价

2.4.1 差示扫描量热分析(DSC)

对FF原粉、物理混合物、FF-NC进行DSC分析。分别称取约5mg于瓷坩埚中，以氮气为保护气，扫描范围从30～280℃，升温速度10℃/min。

2.4.2 X射线衍射分析(XRD)

分别取适量FF原粉、物理混合物、FF-NC，采用X射线衍射仪进行分析，得到X射线衍射图谱。电流电压为40kV，30mA，2θ测试范围5～55°，扫描步距0.02°，扫描速率为4°/min。

2.4.3 傅里叶红外光谱分析(FTIR)

分别取适量FF原粉、物理混合物、FF-NC，KBr将其分别压片，测试各样品的红外吸收图谱。扫描波长为400～4000cm-1；分辨率为4cm-1，每个样品平均扫描3次。

2.4.4 溶解度的测定

采用摇瓶法测定样品的饱和溶解度[13]。分别取适量FF原粉、物理混合物、FF-NC于50mL具塞锥形瓶中，加入20mL的蒸馏水进行溶解，超声15min后置于(25±0.5)℃恒温摇床中，振摇速度为100r/min。48h后取出，取上清液过0.22μm水系微孔滤膜，以蒸馏水稀释一定倍数，采用HPLC法测定FF含量，计算饱和溶解度。

2.4.5 体外溶出度考察

按《中华人民共和国兽药典》2015年版一部附录160第二法(桨法)测试FF原粉、物理混合物、FF-NC的溶出速率。称取FF原粉、物理混合物、FF-NC适量(相当于FF原粉200mg)，以蒸馏水为溶出介质，体积为900mL，转速为100r/min，温度为(37±0.5)℃。分别于5、10、20、30、45和60min取样5mL，同时补充相同体积的介质，过孔径0.22μm水系微孔滤膜，取续滤液，采用HPLC法测定FF的含量，计算FF的溶出度，绘制溶出曲线。采用相似因子法对FF-NC的体外释放行为进行评价。

其中Rt和Tt分别为纳米结晶及药物与辅料的物理混合物在t取样时间点的累积释放度；f2的数值范围在0～100，而且f2越大，两条曲线的相似性越高，n为取样次数。f2越大，拟合度越高，f2≥50，即表示两者的释放行为相似，若f2＜50，则表示两条曲线的释放行为不相似。

2.5 初步稳定性评价

分别取FF原粉、FF-NC适量置于敞口玻璃皿中，平摊成＜5mm的薄层，放置在温度为40℃，相对湿度为75%条件下，于0和30d分别取样，对其休止角、堆密度、含量、1h溶出率、再分散性能(粒径与PDI) 进行考察，初步评价储存稳定性。

3 结果与分析

3.1 单因素考察结果

单因素考察结果见图1。从图1(A)可知，单独使用一种稳定剂(包括高分子聚合物、离子性表面活性剂、非离子型表面活性剂)都不能有效降低纳米结晶的粒径和增加纳米粒子的稳定性，分析其中原因，在制备FF纳米结晶时，上述单一稳定剂均不足以提供足够的立体稳定使颗粒之间形成足够的空间或者是足够静电排斥作用。根据预实验结果，选用复合稳定剂制备FF纳米结晶。图1(B)中复合稳定剂筛选结果表明，将立体稳定型稳定剂如HPMC、PVP、CMC-Na与静电稳定型的离子型表面活性剂SDS联合使用对FF-NC粒径的减小和粒子稳定有显著作用。综合考虑下选用HPMC+SDS制备FF-NC。图1(C)表明，在考察的转速范围内，当转速从600r/min升高至900r/min时，粒径从871nm降低至308nm，可见NC的粒径大小受转速的影响较大。而随着转速的继续增加，粒径反而有所增大，原因可能是转速继续升高，粒子间单位时间内碰撞程度增加，加速聚集，导致粒径增加。另外，转速加快使得氧化锆珠之间的碰撞加剧，导致温度上升，对药物的稳定性产生不利影响，影响仪器寿命。图1(D)表明，随着研磨时间的增加，FF-NC的粒径和PDI基本呈减小的趋势，当研磨时间达一定时长，继续增加研磨时间，FF-NC的粒径及PDI基本不再减小。

3.2 正交试验优化结果

正交试验优化结果见表3～4。由正交实验结果可知，转速大小对粒径影响最为显著，其次为研磨时间，稳定剂浓度比例对粒径影响最小。方差分析结果表明，B因素的影响具有显著性意义；A、C因素的影响无显著性意义。最佳处方与工艺组成为A2B2C2，即稳定浓度为HPMC 0.5%+SDS 0.1%，转速为900r/min，研磨时间为8h。

图1 单一稳定剂(A)、复合稳定剂(B)、研磨速度(C)和研磨时间(D)对粒径大小和PDI的影响Fig.1 Effects of single stabilizer (A), compound stabilizer (B), grinding speed (C), grinding time (D) on particle size and PDI

表3 正交试验结果Tab.3 Results of orthogonal test

表4 方差分析表Tab.4 Analysis of variance

3.3 FF-NC制备工艺验证结果

图2结果表明，重复制备3批次的FF-NC平均粒径，PDI与前述优化过程所得结果基本一致，表明微型化介质研磨法制备FF-NC的工艺稳定可行。

3.4 FF-NC体外评价

3.4.1 复溶FF-NC粒径分布结果

图3结果表明，经喷雾干燥固化后的FF-NC，在蒸馏水中复溶后，粒径基本不变，再分散性良好。

3.4.2 DSC结果

图4 DSC结果表明，FF原粉的特征吸热峰出现在153℃，FF-NC的DSC曲线图谱则显示，药物原来的吸热峰已完全消失，表明FF-NC中药物呈无定型状态。

3.4.3 XRD结果

如图5所示，FF原粉在衍射角2θ为8.09°、16.22°、21.01°、24.42°、26.87°、31.82°、41.25°和43.49°时衍射强度最大，并在15～30°有较强指纹性衍射图谱，表明氟苯尼考原药具有特定的晶体形态。在物理混合物中，氟苯尼考原粉主要的特征峰得到保留，存在晶态的尖峰，特别是2θ为8.09°、16.22°和21.01°。分析结果表明，药物和稳定剂的物理混合物中含有原药的特征衍射峰，表明辅料的存在不会影响药物的结晶型态；在FF-NC的XRD图谱中FF的特征衍射峰消失，表明经研磨和干燥过程后药物呈无定型状态。

图2 最优处方验证结果Fig.2 The result of optimal prescription verification

图3 复溶FF-NC粒径分布Fig.3 Size distribution of FF-NC after redissolution

图4 差式扫描量热分析结果Fig.4 Results of differential scanning calorimetry analysis

3.4.4 FTIR结果

图6红外光谱图及数据表明，FF在3452cm-1处为-OH的伸缩振动峰，1683cm-1处为-C=O的伸缩振动峰，1532cm-1处为-NH的弯曲振动和-CN的伸缩振动峰。1276cm-1处有-CN的弯曲振动和-NH的伸缩振动吸收峰，500～800cm-1为C-Cl伸缩振动峰。FF纳米结晶干燥粉与物理混合物的红外光谱图基本一致，并且氟苯尼考的特征吸收峰还存在，说明在制备过程中氟苯尼考自身的化学结构没有发生变化。

图5 X-射线衍射图谱Fig.5 X-Ray diffraction patterns of different samples

图6 红外光谱图结果Fig.6 IR spectra of the samples

3.4.5 溶解度的测定结果

表5溶解度实验结果表明，将FF制备成无定型的纳米结晶之后，饱和溶解度较FF原粉提升近2倍。在48h内未观测到FF-NC出现明显的重结晶现象。说明制成无定型纳米结晶对FF有一定的增溶作用，其水溶性有所提高。

3.4.6 体外溶出度结果

图7体外溶出结果表明，FF-NC显著提高了FF在水中的溶出速度，在5min时FF-NC和物理混合物的溶出度分别为96.89%和65.54%，将FF-NC及物理混合物各点溶出数据代入“2.4.5”项下公式，计算得到f2=39＜50，说明FF-NC与物理混合物的释放行为不相似。而FF原粉溶出速度缓慢，在60min时累积溶出百分率＜30%，而FF-NC未见重结晶析出。以上结果说明将FF制备成纳米结晶可以显著提高FF的溶出速率。

表5 溶解度实验结果Tab.5 Results of solubility test (±s, n=3)

表5 溶解度实验结果Tab.5 Results of solubility test (±s, n=3)

类型饱和溶解度/(mg/mL)FF原粉1.159±0.080物理混合物1.255±0.017 FF-NC2.316±0.060

图7 FF体外溶出度实验结果Fig.7 Result of in vitro dissolution test (±s, n=6 )

3.5 初步稳定性考察结果

初步稳定性考察结果见表6～7。结果发现FF-NC的各项考察指标均未发生显著变化，表明在此条件下该FF-NC性质稳定。

4 讨论

合适的稳定剂是保证纳米结晶稳定的前提。稳定剂的稳定机制主要有以下3种：立体稳定、静电稳定以及静电-立体稳定。其中常用的立体稳定剂主要是一些高分子聚合物，通过吸附水中悬浮的固体粒子，使粒子间架桥形成足够的空间。静电稳定主要是通过离子间的静电作用减少颗粒之间的斥力。在FF-NC的稳定剂筛选中，将立体稳定剂与静电稳定剂联用取得了比较好的效果，这是因为立体稳定剂的空间位阻和静电稳定剂的电荷斥力的协同作用使得纳米粒子的稳定效果相较于单独使用效果大大提升[14]。当HPMC与SDS联用时，稳定效果最令人满意。推测其原因，可能是HPMC和SDS在水中相互作用，HPMC提供成核的位点，SDS沿着其主链发生胶束化，增强HPMC在纳米粒子表面的吸附作用以提高FF-NC的稳定性。

表6 FF原粉初步稳定性考察结果Tab.6 preliminary stability investigation results of FF raw powder (n=3)

表7 FF-NC初步稳定性考察结果Tab.7 Preliminary stability investigation results of FF-NC(n=3)

本研究在正交优化过程中采用了粒径跨度(Span值)作为评价指标，Span值包含D90、D50和D103个参数，数值越小表示粒子分布越均匀。相较于单独使用粒径作为评价指标更具有代表性。

微型化介质研磨可用于制备纳米结晶时多种稳定剂同时多批量筛选研究，大大节省了研究时间，同时为放大化生产提供了参考依据。本研究中采用微型化介质研磨法，进行单因素试验，正交优化制备了粒径较小的FF-NC，采用PHN Labstar 0.5CE纳米砂磨机，将筛选出最优处方等比例放大，并进行喷雾干燥固化得到FF-NC固体粉末，复溶后粒径基本不变，并且再分散性良好。体外溶出结果中，FF-NC的累积溶出度在5min内即可达90%以上，分析原因如下：一是药物在经过研磨之后呈无定型状态，药物饱和溶解度随结晶程度的降低而增大[15]；二是FF-NC的晶格能减小，溶解需要的能量变小，这也是FF-NC溶解度增加与溶解速度加快的原因。FF-NC的体外溶出度明显优于FF原粉，FF原粉60min内最大累积溶出度仅在30%以下。

纳米结晶能有效改善难溶性药物的溶解度问题, 但其属于液体制剂, 稳定性差, 不易携带, 固化是相关研究的新方向。固化后得到的粉体作为一种中间制剂，其粉体流动性对后续颗粒剂、片剂、胶囊剂的成型，装量均有重要影响[16]。将本实验固化得到的FF-NC置于温度40℃，相对湿度75%的条件下，发现其粉体学流动性及考察的各项指标均无显著变化，说明其物理稳定性良好，可较长时间储存，但长期稳定性仍有待考察。

微型化介质研磨法制备FF-NC可在短时间内完成，且装置易得，研磨效率高，为处方的筛选提供了极大的便利。虽然装置体积及动力有限，但对于放大化制备纳米结晶具有一定的指导意义。本实验中等比例放大化制备FF-NC并固化后，改善了FF的水溶性，有利于提高其生物利用度。