法尼基转移酶抑制剂诱导小鼠胰岛素瘤胰岛β细胞凋亡的实验研究

郭贤利，郭姝彤，符兆英

(延安大学医学院，陕西 延安 716000)

法尼基转移酶抑制剂(Farnesyltransferase inhibitor)可作用于Ras-ERK/MAPK信号转导通路，抑制肿瘤细胞的增殖，在国外已被广泛用于恶性肿瘤分子靶向治疗的研究，有的制剂已经进入了临床I期或II期研究，但在国内对法尼基转移酶抑制剂的研究和报道尚不多[1-6]。我们将法尼基转移酶抑制剂R115777用于诱导小鼠胰岛素瘤胰岛β细胞系Beta-TC-6细胞的凋亡，以探讨其作为抗肿瘤药物的理论基础，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

细胞培养基DMEM购自Cibco公司，用前添加4 Mm/L-谷氨酰胺、4.5 g/L葡萄糖及1.5 g/L碳酸氢钠。胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，用前在水浴箱中56 ℃，30 min灭活。法尼基转移酶抑制剂R115777、二甲苯噻唑-2，5联苯四唑溴(MTT)、二甲基亚砜、碘化丙啶购自Sigma公司。Beta-TC-6小鼠胰岛素瘤胰岛β细胞，购自中国科学院细胞库。

1.2 细胞培养

将BETA-TC-6细胞在含胎牛血清15%、青霉素100 U/mL及链霉素100 g/mL的DMEM培养基中，在37 ℃、5%CO2和饱和湿度条件下常规培养，每2～3天传代一次，用于对数生长期的细胞做加药后细胞增殖抑制与凋亡诱导的研究。

1.3 MTT法检测细胞增殖抑制率

将处于对数生长期的BETA-TC-6细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，用含10%胎牛血清DMEM培养液制成3×105细胞/mL的悬液，接种于96孔板中，每孔100 μL，留几个边缘孔不加细胞，只加细胞培养液作为空白对照，5%CO2，37 ℃，饱和湿度培养。至细胞单层铺满孔底80%左右，加入梯度浓度的法尼基转移酶抑制剂R115777 0.5 μmol/L、1.5 μmol/L、2.5 μmol/L、3.5 μmol/L，每个浓度设5个复孔，并留5个孔不加药、只加细胞培养液做阴性对照，在37℃，5%CO2的饱和湿度条件下培养24 h。向各孔加入20 μL 5 mg/mLMTT溶液(0.5%MTT)，继续培养4 h。吸去各孔内含MTT培养液，每孔加入150 μL二甲基亚砜，室温下轻摇30 min。用酶联免疫检测仪(美国Bio-Rad)在波长490 nm处测量各孔的吸光值(OD490)。用以下公式计算细胞增殖抑制率：细胞增殖抑制率=(阴性对照孔平均OD值-试验孔平均OD值)/阴性对照孔平均OD值。

1.4 碘化丙啶染色观察凋亡细胞形态

对数生长期的BETA-TC-6细胞，用0.25%胰蛋白酶消化成单细胞悬液，用10%胎牛血清DMEM培养液调整细胞浓度为3×105细胞/mL，接种于置有无菌盖玻片的6孔细胞培养板中，5%CO2，37℃，饱和湿度条件下培养24 h后，分别加入浓度为1.5 μmol/L、2.5 μmol/L、3.5 μmol/L的法尼基转移酶抑制剂R115777，同时设不加试剂的对照孔，继续5%CO2，37℃，饱和湿度培养。24 h后收集细胞，以1000 r/min离心5 min，弃去上清液，用5 mL PBS洗一次，加入500 μL冰预冷的70%乙醇，4℃固定1 h，离心弃除固定液，用5 mL PBS洗一次，用PBS 2 mL重悬细胞，加入20 μL碘化丙啶(浓度50 mg/L)，充分混匀，室温避光染色30 min，加5 mL PBS，1000 r/min离心5 min，弃上清，洗2次后重悬细胞并滴片，用盖玻片封片。用荧光显微镜(氩离子激发光源)观察细胞核的染色和形态改变、染色质凝聚等情况。

1.5 流式细胞术检测

流式细胞术样品准备：用六孔板培养BETA-TC-6细胞，当细胞铺满孔底约80%后，用R115777对细胞进行24 h处理，收集细胞约106个，1000 r/min离心5 min，弃去培养液，用3 mL PBS洗一次。离心去除PBS，加预冷的70%乙醇4 ℃固定1 h。离心去除固定液，加3 mL PBS重悬细胞。400目尼龙网过滤1次，1000 r/min离心5 min，弃去上清。加1 mL PI染液，在4℃下避光染色30 min。流式细胞仪检测：用氩离子作为激发光源，激发光波长488 nm，发射光波长大于630 nm，为红色荧光。分析DNA含量直方图、亚G1期细胞所占百分比和细胞周期改变。

2 结果

2.1 MTT检测显示R115777对BETA-TC-6细胞增殖的影响

MTT试验结果显示，R115777对BETA-TC-6细胞的增殖有抑制作用，呈剂量依赖性(见表1)；各个浓度的R115777作用24 h和作用48h的平均OD490值相比，没有显著性差异(P>0.05)。

2.2 荧光显微镜下观察R115777作用后BETA-TC-6细胞形态学改变

BETA-TC-6细胞经R115777作用24 h后，用碘化丙啶染色，在荧光显微镜下，可观察到细胞核和染色质出现凋亡的形态改变。对照组的细胞形态较规整，核较大而圆整。经R115777作用后，出现细胞形态不规则、细胞核缩小、核染色质凝聚和碎裂等改变(见图1)。上述改变随R115777作用浓度的增大而更加明显。

表1 法尼基转移酶R115777对BETA-TC-6细胞的增殖抑制作用

注：☆与对照组比P>0.05，*与对照组比P<0.05，a与0.5 μmol/L组比P<0.05，b与1.5 μmol/L组比P<0.05，c与组2.5 μmol/L比P<0.05。

图1小鼠胰岛素瘤胰岛β细胞Beta-TC-6用法尼基转移酶抑制剂R115777处理后碘化丙啶染色的荧光显微镜形态。左图为未加药的细胞，右图为凋亡细胞。

2.3 流式细胞术显示R115777引起BETA-TC-6细胞DNA含量和细胞周期改变

用R115777处理24 h的BETA-TC-6细胞，用碘化丙啶染色后，进行流式细胞术检测分析，结果发现，处理组细胞在DNA直方图上可见明显的亚G1峰，处理组细胞凋亡率达79.8%，而对照组细胞凋亡率仅为5.6%。表明R115777明显地诱导了BETA-TC-6细胞的凋亡。细胞周期分析结果显示，用R115777处理24h的BETA-TC-6细胞，有42%处于G2/M期，而对照组细胞仅有16%处于G2/M期，表明R115777处理后，BETA-TC-6细胞发生了G2/M期阻滞。

3 讨论

胰岛素瘤又称胰岛β-细胞瘤，是胰岛细胞瘤中最常见的一种肿瘤，占胰岛细胞肿瘤的70%～75%。胰岛素瘤以反复发作的空腹时低血糖症为特征，是器质性低血糖症较常见的原因。本病约83%为胰岛β细胞良性肿瘤，约7%为β-细胞增生，恶性肿瘤不到10%。约91.4%的胰岛素瘤为单发，瘤体一般较小，直径在1～2.5 cm者占82%左右[7-8]。尽管瘤体积小，但其不受调控的胰岛素大量分泌可引起严重的临床后果。胰岛素由胰岛β-细胞经“膜融合”和“kiss-and-run”两种方式分泌[9]，在正常情况下，胰岛素的分泌受血糖浓度的负反馈调节，当血糖浓度下降时，胰岛素的分泌受到抑制，当血糖降至1.94 mmol/L时，胰岛素分泌几乎完全停止。但在胰岛素瘤，这种生理反馈机制完全丧失，瘤细胞持续地分泌胰岛素，不受血糖浓度调节，因而导致低血糖的发生。人体脑细胞的代谢活动只能依赖葡萄糖而不能利用糖原提供能量，故反复发作的低血糖可对中枢神经系统造成严重损伤。由于胰岛素瘤体积一般较小，临床上不易定位诊断，导致了手术切除的困难。因此，探索非手术治疗的方法很有必要[10-12]。

近些年来，抗肿瘤药物的研究正从细胞毒作用向分子靶向治疗的方向发展，法尼基转移酶抑制剂即是以肿瘤细胞信号转导通路为作用靶点的抗肿瘤药物。法尼基转移酶抑制剂通过抑制包括Ras蛋白在内的多种蛋白质的法尼基化修饰而发挥抗肿瘤作用[1]。

Ras蛋白是一类由Ras基因编码、具有结合GTP功能的蛋白质，有分子开关之称，可在有活性的GTP结合型与无活性的GDP结合型两种形式之间循环变换，是参与细胞信号转导、调节细胞增殖和分化的关键性分子。Ras蛋白与GTP结合后，其GTP酶活性可将GTP水解成GDP而使后者失去作用，Ras基因突变后，其GTP酶活性降低，不能有效地将GTP水解成GDP而使其失活，引起信号转导紊乱，导致细胞持续增生而发生肿瘤[2]。

研究表明，Ras蛋白只有在结合于细胞膜内侧之后，才具有生物学活性。但Ras蛋白本身由于疏水性差，不容易结合于脂质的细胞膜，需要经过加工修饰以后，才能定位于细胞膜内侧。该加工修饰是在Ras蛋白翻译后进行的，是在法尼基转移酶的催化下，将胆固醇合成途径中的中间体法尼基焦磷酸酯上的法尼基(一个15碳的类异戊二烯基团)，转移到Ras蛋白的CAAX四肽结构(C=半胱氨酸，A=脂肪族氨基酸，X=丝氨酸或甲硫氨酸)中半胱氨酸残基的-SH功能基团上。这一加工修饰称为法尼基化修饰，对Ras蛋白的膜定位和生物学活性是必需的。法尼基转移酶是催化该反应的关键酶，抑制其活性，即可阻断Ras蛋白的法尼基化修饰，从而可以有效地抑制Ras蛋白的信号转导功能，抑制Ras促进的肿瘤细胞生长[3]。

本实验用法尼基转移酶抑制剂R115777作用于小鼠胰岛素瘤胰岛β细胞Beta-TC-6，经MTT法检测细胞增殖抑制率、碘化丙啶染色在荧光显微镜下观察凋亡细胞形态改变和流式细胞术检测细胞DNA含量和细胞周期改变，结果发现，R115777处理能使BETA-TC-6细胞发生明显的细胞凋亡。因此，法尼基转移酶抑制剂R115777有希望作为一种作用于肿瘤细胞信号转导通路的分子靶向治疗的抗肿瘤药物。