血清miR-155联合HE4、CA199诊断子宫内膜癌的价值

陈玉芬 韩敏 张秀俊 苏海飞 张肖

[摘要] 目的 探讨血清miR-155联合人附睾蛋白4（HE4）、糖类抗原199（CA199）诊断子宫内膜癌（EC）的价值。方法 选取2016年6月～2018年6月河北省邯郸市第一医院肿瘤科收治的68例EC患者为EC组，60例子宫内膜增生患者为内膜增生组，60名健康体检健康者为对照组。检测并比较三组血清miR-155、HE4、CA199水平，分析其对EC患者诊断价值。 结果 EC组、内膜增生组患者血清miR-155、HE4、CA199水平均高于对照组（P < 0.05），且EC组高于内膜增生组（P < 0.05）;EC病理分级G3、G2级患者血清miR-155、HE4、CA199水平均高于G1级患者（P < 0.05），G3级患者高于G2级患者（P < 0.05）;EC FIGO分期Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者血清miR-155、HE4、CA199水平均高于Ⅰ期患者（P < 0.05），Ⅲ期、Ⅳ期患者高于Ⅱ期患者（P < 0.05），Ⅳ期患者高于Ⅲ期患者（P < 0.05）;绘制ROC曲线显示，三者联合检测的AUC、敏感性、特异性均高于单独检测。 结论 EC患者血清miR-155、HE4、CA199均高表达，且随患者病理分级、FIGO分期升高而升高，三者联合诊断敏感性、特异性高，对EC患者早期诊断具有较高临床价值。

[关键词] 子宫内膜癌;miR-155;人附睾蛋白4;糖类抗原199;诊断价值

[中图分类号] R737.33          [文献标识码] A          [文章編号] 1673-7210（2019）07（b）-0100-04

Diagnostic values of serum MiR-155 combined with HE4 and CA199 in endometrial cancer

CHEN Yufen1   HAN Min1   ZHANG Xiujun1   SU Haifei2   ZHANG Xiao1

1.Department of Obstetrics and Gynecology， Handan First Hospital， Hebei Province， Handan   056002， China; 2.Department of Obstetrics and Gynecology， the People′s Hospital of Guantao County， Hebei Province， Guantao   057750， China

[Abstract] Objective To investigate the diagnostic values of serum miR-155 combined with human epididymal protein 4 （HE4） and carbohydrate antigen 199 （CA199） in endometrial cancer （EC）. Methods Thirty-right patients with EC admitted to Oncology Department of Handan First Hospital in Hebei Province from June 2016 to June 2018 were selected as the EC group， 60 cases of endometrial hyperplasia patients were selected as the endometrial hyperplasia group， 60 healthy persons were taken as control group， the levels of serum microRNA-155， HE4 and CA199 were detected and compared among the three groups， and their diagnostic value for EC patients was analyzed. Results The levels of serum miR-155， HE4， and CA199 in EC group and endometrial hyperplasia group were higher than those in control group （P < 0.05）， and those in EC group were higher than those in endometrial hyperplasia group （P < 0.05）; the levels of serum miR-155， HE4， and CA199 in EC patients with pathological grades G3 and G2 were higher than those in patients with grade G1 （P < 0.05）， while those in patients with grade G3 were higher than those in patients with grade G2 （P < 0.05）; the levels of serum miR-155， HE4， and CA199 in EC patients with stage Ⅱ， Ⅲ， and Ⅳ of FIGO were higher than those in patients with stage Ⅲ （P < 0.05）， those in patients with stage Ⅲ and Ⅳ were higher than those in patients with stage Ⅱ （P < 0.05）， and those in patients with stage Ⅳ were higher than those in patients with stage Ⅲ （P < 0.05）. The ROC curve showed that the AUC， sensitivity and specificity of the combined detection were higher than those of the single detection. Conclusion Serum miR-155， HE4， and CA199 are highly expressed in EC patients， and with the increases of pathological grade and FIGO stage， the sensitivity and specificity of the combined diagnosis are high， which has high clinical value for early diagnosis of EC patients.

[Key words] Endometrial carcinoma; MiR-155; Human epididymis protein 4; Carbohydrate antigen 199; Diagnostic value

子宫内膜癌（endometrial carcinoma，EC）是女性生殖系统常见恶性肿瘤之一，其发病率占全球妇科恶性肿瘤第二位，并呈逐年升高趋势，严重影响女性生命健康和生活质量[1]。EC晚期患者5年生存期仅为30%～40%，随着手术治疗技术的不断改进，患者生存时间相对提高，但术后复发和淋巴结转移仍较高。因此，寻找EC早期诊断指标对提高患者生存率极其重要[2-3]。人附睾蛋白4（human epididymis gene product 4，HE4）在正常人血清中低表达，而在EC患者血清中高表达，糖类抗原199（carbohydrate antigen199，CA199）常作为消化道肿瘤鉴别诊断指标，有研究报道，CA199在EC患者血清中表达水平高于健康女性，HE4和CA199可作为EC早期诊断检测指标[4-5]。微小RNA（microRNA，miRNA）参与多种恶性肿瘤的发生、发展，有研究报道miR-155在EC患者组织和血清中均高表达，但关于血清miR-155、HE4、CA199联合检测对EC患者诊断价值的研究报道较少[6]。因此，本研究旨在探讨血清miR-155联合HE4、CA199对EC患者的诊断价值，报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年6月～2018年6月河北省邯郸市第一医院肿瘤科收治的68例EC患者为EC组，60例子宫内膜增生患者为内膜增生组，60例健康体检健康者为对照组。纳入标准：①患者均经组织病理学确诊;②均为初次确诊患者;③受试者对本研究知情并签署知情同意书。排除标准：①入组前有放化疗及免疫治疗史;②入组前6个月内有性激素使用史;③合并严重心、肝、肾等功能衰竭;④伴发严重感染及严重并发症;⑤合并其他部位恶性肿瘤。EC组患者年龄42～65岁，平均（50.34±4.62）岁;病理分级：G1级17例，G2级42例，G3级9例;FIGO分期：Ⅰ期15例，Ⅱ期28例，Ⅲ期18例，Ⅳ期7例。内膜增生组年龄35～58歲，平均（48.85±4.73）岁;子宫内膜不典型增生21例，子宫内膜单纯性增生39例。对照组年龄32～63岁，平均（49.58±6.12）岁。三组受试者年龄等一般资料比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。

1.2 试剂与仪器

TRI Reagent BD RNA试剂、逆转录试剂盒、qRT-PCR试剂盒均购自美国Gene Copoeia公司（生产批号：1611249、1608164、1512271）;HE4酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒购自英国Abcam公司（生产批号：0509283）;CA199试剂盒购自美国雅培公司（生产批号：69217）;全自动酶标仪购自美国赛默飞世尔公司;全自动电化学发光分析仪购自德国罗氏公司;普通PCR仪德国Eppendorf公司;荧光定量PCR仪、紫外凝胶成像分析系统均购自美国Bio-Rad公司;PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 检测方法

①miR-155检测：采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测受试者血清miR-155水平，miR-155上游引物序列：5′-GCGAAAGCATTTGCCAAGAA-3′，下游引物序列：5′-CATCACAGACCTGTTATTGC-3′，内参基因U6上游引物序列：5′-AGCGGGAAATCGTGCGTGACA-3′，下游引物序列：5′-GTGGACTTGGGAGAGGACTGG-3′，取待测血清提取总RNA，严格按照试剂盒说明书操作，测定浓度和纯度，符合要求方可进行cDNA合成。冰盒上配制cDNA合成反应体系，反应体系：5×ReactionBuffer 4 μL、特异性引物1 μL、10 mmol/L dNTP Mix 2 μL、Ribolock RNase Inhibitor 1 μL、RevertAid M-MuLV RT 1 μL、总RNA 5 μL、无RNA酶水6 μL;反应条件：25℃ 5 min、42℃ 40 min、75℃ 5 min，进行cDNA合成，于-20℃保存备用。qRT-PCR检测，以U6为内参基因，合成cDNA为模板，配制反应体系，反应体系：Maxima SYBR Green qPCR 10 μL、上游引物1 μL、下游引物0.4 μL、cDNA模板1 μL、ddH2O 7.6 μL，设置3个重复，反应条件：95℃ 30 s、95℃ 3 s、60℃ 30 s，40个循环，进行PCR扩增，采用2-△△Ct方法计算 miR-155相对表达量。②HE4检测：采用ELISA检测血清HE4水平，设置标准品孔、待检样品孔及空白孔，操作步骤严格参照试剂盒说明书执行，采用酶标仪在450 nm处检测吸光度值，计算HE4浓度。③CA199检测：电化学免疫发光法检测血清CA199水平，严格按照试剂盒说明书进行实验操作，所有检测步骤由同一人操作。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用LSD-t检验;计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验。采用受试者工作特征曲线（ROC曲线）预测血清miR-155、HE4、CA199对EC诊断价值。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组血清miR-155、HE4、CA199水平比较

EC组、内膜增生组患者血清miR-155、HE4、CA199水平均高于对照组，且EC组高于内膜增生组，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

2.2 不同病理分级EC患者血清miR-155、HE4、CA199水平比较

EC病理分级G2、G3级患者血清miR-155、HE4、CA199水平均高于G1級患者，G3级患者高于G2级患者，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

2.3 不同FIGO分期EC患者血清miR-155、HE4、CA199水平比较

EC FIGO分期Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者血清miR-155、HE4、CA199水平均高于Ⅰ期患者（P < 0.05），Ⅲ期、Ⅳ期患者高于Ⅱ期患者（P < 0.05），Ⅳ期患者高于Ⅲ期患者（P < 0.05）。见表3。

2.4 血清miR-155、HE4与CA199联合诊断EC价值

分别以EC患者血清miR-155、HE4与CA199表达水平绘制ROC曲线显示，联合检测的AUC、敏感性、特异性及约登指数均高于单独检测。见表4、图1。

3 讨论

EC高发于50～60岁女性，特别是绝经后女性，成为与卵巢癌、宫颈癌并列的女性生殖道三大恶性肿瘤之一[7-8]。EC的发病原因较多，可能与体质、雌激素水平、遗传等因素相关，其发病机制尚不明确[9]。肿瘤标志物是一种化学物质，往往在正常组织中不表达或低表达，但在肿瘤组织中常常高表达，常作为肿瘤的辅助诊断指标，对肿瘤早期诊断及预后具有重要作用。

miR-155属于miRNA，其表达水平升高可促进细胞异常增殖、肿瘤细胞侵袭、转移。有研究报道miR-155在肝癌细胞中过表达，转染肝癌细胞72 h后可促进肝癌细胞增殖，同时增强癌细胞浸润能力[10-11]。Han等[12]研究发现miR-155在乳腺癌患者血清中高表达，具有较高诊断敏感性和特异性，可作为乳腺癌早期诊断潜在生物标志物。本研究结果显示，miR-155在EC、子宫内膜增生患者血清中均高表达，EC患者高于子宫内膜增生患者，与上述研究结果基本相似，提示miR-155可能参与EC癌变过程。HE4最早在人附睾中克隆获得，有研究发现HE4可作为EC单一肿瘤标志物，并在EC不同肿瘤分期中有明显表达差异[13]。CA199是一种糖类抗原，在女性生殖道肿瘤与消化道肿瘤中高表达，但灵敏性和特异性较差，常和其他肿瘤标志物进行联合检测[14-15]。本研究结果显示，HE4、CA199在EC、子宫内膜增生患者血清中高表达，且EC患者高于子宫内膜增生患者，与既往的研究[15-16]结果基本相似，提示血清HE4、CA199可用于EC的诊断。进一步分析在EC病理分级和EC FIGO分期表达显示，血清miR-155、HE4、CA199水平随EC的病理分级和FIGO分期升高而增加，与Zhang等[17]和张智等[18]研究结果基本相似，提示血清miR-155、HE4、CA199表达水平与EC的病理分级和FIGO分期相关，可作为EC患者疾病严重程度的评估指标。准确评估EC患者疾病严重程度有利于选择治疗效果较佳的治疗方案，而以往病情严重程度的评估主要以有创检查为依据，给患者病情动态观察及随访带来诸多不便，因此，可选择采用血清miR-155、HE4、CA199水平检测评估EC病情严重程，且方法简便、快捷[19]。最后，本研究通过ROC曲线分析显示，三者联合检测的AUC、敏感性、特异性均高于单独检测，与刘晓良等[20]和Choi等[21]研究结果相似，提示血清miR-155、HE4、CA199联合诊断EC的灵敏度和特异性高，可提高EC患者诊断效率。

综上所述，本研究通过对EC患者血清miR-155、HE4、CA199水平检测显示，EC患者血清miR-155、HE4、CA199表达水平升高，并与患者病理分级、FIGO分期相关，三者联合诊断敏感性、特异性高，对EC患者早期诊断及预后随访有较高的临床价值。

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