海参肠道产蛋白酶菌的分离鉴定及其在海参下脚料中的应用

李震，肖秧，甄天元，朴美子

(青岛农业大学 食品科学与工程学院，山东 青岛，266109)

蛋白酶是水解蛋白质肽链的一类酶的总称，它在消化吸收[1-2]、抗氧化[3-4]、降低过敏反应[5]、洗涤剂添加剂[6]、生物活性肽[7-9]等方面发挥着重要作用。目前，蛋白酶的种类主要分为动物蛋白酶[10-11]、植物蛋白酶[12]和微生物蛋白酶[13]。微生物菌群复杂多样，分布较广，繁殖速度较快，具有参与体内新陈代谢，调节内分泌，免疫调节等多种作用[14-15]。海洋微生物酶是一种获得新型酶制剂方式[16]，在工业过程和产品制作得到广泛应用[17-18]。王凤舞等[19]对来自裙带菜的1株产低温碱性蛋白酶内生菌株QD-1，经鉴定该菌株为芽孢杆菌属，该菌产生的蛋白酶的最适作用温度为20 ℃，最适作用pH 9.0，Mn2+对该酶有较强的激活作用，Zn2+，金属蛋白酶抑制剂(ethylenediaminetetra aceticacid，EDTA)和丝氨酸蛋白酶抑制剂(phenylethanesulfonyl fluoried,PMSF)对该酶有抑制作。李倩倩等[20]以单环刺螠内脏为原料，分离出1种单环刺螠内脏蛋白酶LPN2，分子质量约59 ku，其最适温度为50 ℃，最适pH 6～8，PMSF、EDTA、Ca2+、Zn2+和Ba2+抑制蛋白酶LNP2的酶活，Fe2+在低浓度下对该酶有激活作用。BANERJEE等[21]从鱼肠中分离的细菌菌株棒状杆菌ATH3产生的胞外蛋白酶和淀粉酶，纯化的蛋白酶和淀粉酶的分子质量分别为17和28 kDa，酶的最适pH 7.5～8.0，最适温度35～45 ℃。目前，人们已经从海参体壁[22]、肠[23]和消化道[24]提取出蛋白酶粗酶，而对从海参肠中分离出蛋白酶菌株的研究较少。

本研究拟从海参肠道中分离筛选出1株产蛋白酶活性较高的菌株，对该菌株进行鉴定，以酶活力为指标，对其产酶发酵条件进行优化；利用该菌发酵海参肠产多肽，优化了发酵工艺条件，并对海参肠发酵产物多肽的抗氧化活性进行测定。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活刺参(Apostichopusjaponicas)：由青岛佳日隆海洋食品有限公司提供；海参肠(经水煮，去杂质，脱盐，初步脱脂后沥干而成)：由青岛佳日隆海洋食品有限公司提供，于-20 ℃保存；干红枣：福建古田县大丰工贸有限公司；苹果醋：鹤山市东古调味食品有限公司售；蜂蜜：山东华康蜂业有限公司售。

固体培养基：LB营养琼脂3.3 g，海水100 mL，121 ℃灭菌15 min。酪蛋白培养基：干酪素1 g，酵母膏0.1 g，琼脂1.5 g，海水100 mL，pH 7.2-7.4，121 ℃灭菌15 min。液体培养基：蛋白胨0.5 g，酵母膏0.1 g，磷酸高铁0.01 g，海水100 mL，pH 7.8～8.0，121 ℃灭菌15 min。

酪蛋白(casein)：上海索莱宝生物科技有限公司；偶氮酪蛋白(azocasein)：美国Sigma公司；三羟甲基氨基甲烷(Tris)：美国Sigma公司；其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

DU-800型紫外分光光度计，美国贝克曼公司；TGL-16M型高速台式冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；DHP-9032电热恒温培养箱，中国龙口市先科仪器有限公司；IS-RDV3立式恒温振荡器，美国精骐有限公司；SHA-B水浴恒温振荡器，常州国华电器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌株的分离与鉴定

(1)菌株的分离纯化

取活体刺身内脏，剪碎，按100 g/L加入无菌海水制成菌液原液，梯度稀释后分别涂布于固体培养基， 25 ℃，静置培养3 d。挑取单菌落点接种于酪蛋白培养基，25 ℃，培养24 h，观察透明圈大小。选取菌落周围有透明圈的菌株进行分离纯化。挑取适量的菌株，接种于液体培养基上，25 ℃，180 r/min，3 d，选择产蛋白酶活性较高的菌株为目的菌株。挑取少量菌株接种于固体培养基上，置于25 ℃静置培养3 d，观察目标菌株的菌落形态，并进行革兰氏染色，观察菌株的个体形态，芽孢等。

(2)蛋白酶活性的测定

蛋白酶活性的测定采用参照RANILSON的偶氮酪蛋白法[25]。

(3)形态学及生理生化鉴定

参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰细菌鉴定手册》进行形态学及生理生化鉴定。

(4)16S rDNA序列分析

采用CTAB[26]法提取基因组DNA，PCR产物的纯化和测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。序列提交GeneBank数据库，用Blast软件在GeneBank网站上进行相似性搜索，获取相近典型菌株的16S rDNA基因序列，通过Clustal进行多重序列比对，利用MEGA 5.0软件绘制出系统发育树。

1.3.2 QDHF-1菌株产酶发酵条件工艺优化

参照朱玫瑛[27]的前期单因素试验研究结果，采用L9(33)正交试验，以pH值、温度、发酵时间3个因素为影响因素，以蛋白酶活力为指标，对产酶发酵工艺进行正交优化，因素水平见表1。

1.3.3 QDHF-1菌株发酵海参肠工艺优化及抗氧化活性测定

(1)BSA标准曲线的绘制

将BSA标准品(5 g/L)用生理盐水配置成质量浓度为0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L的溶液，置于离心管中。将BCA试剂盒中的A试剂和B试剂按照50∶1的体积比充分混匀，得到BCA工作液。用移液枪从各浓度的BSA管中吸取20 μL溶液，并与200 μL的BCA工作液充分混匀，置于37 ℃水浴中振摇1 h，用蒸馏水做空白。在562 nm下测定吸光值，绘制BSA标准曲线。

表1 L9(33)正交试验因素及水平Table 1 Factors and levels in L9(33) orthogonalexperiment design

(2)多肽含量的测定

采用BCA法[28]测定样品中的多肽含量。向试管中加入已稀释好的相应倍数的样品溶液20 μL，同时加入已经配好的BCA溶液200 μL，迅速混匀，于水浴37 ℃放置60 min。波长562 nm下测定吸光度值，试验重复3次，根据标准曲线计算样品中多肽的百分含量。

(3)QDHF-1种子液的制备

将Thalassobacillussp. QDHF-1菌株接种到液体培养基上，30 ℃，180 r/min，培养24 h，制备液体种子液培养基。

(4)接种量对QDHF-1发酵海参肠发酵液中多肽含量的影响

取洗净沥干的海参肠用组织捣碎机捣碎，称取5 g，料水比为1∶10，接种量分别为2%、4%、6%、8%、10%，发酵时间为60 h，温度30 ℃，转速180 r/min，培养结束后离心，分别测定上清液的多肽含量。

(5)发酵时间对QDHF-1发酵海参肠发酵液中多肽含量的影响

取洗净沥干的海参肠用组织捣碎机捣碎，称取5 g，料水比(g ∶mL)为1∶10，接种量为6%，发酵时间分别为12、24、36、48、60 h，温度30 ℃，转速为180 r/min，培养结束后离心，分别测定上清液的多肽含量。

(6)料水比对QDHF-1发酵海参肠发酵液中多肽含量的影响

取洗净沥干的海参肠用组织捣碎机捣碎，称取5 g，料水比(g∶mL)分别为1∶1、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20，接种量为6%，发酵时间为36 h，温度30 ℃，转速180 r/min，培养结束后离心，分别测定上清液的多肽含量。

1.3.4 海参肠发酵物抗氧化活性测定

利用QDHF-1菌株发酵海参肠的的最佳工艺条件为接种量6%，料水比1:5，发酵时间36 h，可得到多肽质量浓度达13.21 g/L。海参肠发酵液经离心去除菌体及杂质，再经浓缩、冷冻干燥，获得海参肠发酵物多肽，并对其进行抗氧化测定。

(1)羟自由基(·OH)清除能力的测定采用邻二氮菲-Fe2+氧化法[29]。

(2)二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)清除能力的测定采用ALI等的测定方法[30]。

(3)超氧阴离子自由基(O2-·)清除能力的测定采用邻苯三酚自氧化法[31]。

1.3.5 统计分析方法

试验数据以平均值±标准差(M±S.D.)表示，采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。分析方法为单因素方差分析和邓肯(Duncan)多重比较，显著性水平选择0.05。

2 结果与分析

2.1 产蛋白酶菌株的筛选

海参肠道产蛋白酶菌株的初筛结果如图1和表2所示。经分离得到的5株菌株，菌落直径差异不显著(P>0.05)，但QDHF-1菌株所产的透明圈直径与菌落直径比值显著高于其他菌株(P<0.05)。酪蛋白培养基上水解透明圈直径与菌落直径的比值(D/d值)越大说明产酶能力越强，所以QDHF-1菌株具有较高产蛋白酶的能力。不同菌株发酵液产蛋白酶活力的测定结果如图2所示。其中QDHF-1菌株产的蛋白酶活性较高，产蛋白酶活力为582 U/mL，显著高于其他菌株(P<0.05)。综合水解透明圈和酶活力两个因素，选择QDHF-1菌株为出发菌株。

图1 QDHF-1菌株透明圈实验结果Fig.1 Results of transparent circle test of QDHF-1 strain

表2 海参肠道产蛋白酶菌株初筛结果Table 2 Screening results of protease-producingstrains from tract of sea cucumber

菌落编号透明圈直径(D)/mm菌落直径(d)/mmD/d值QDHF-120.30±0.57d6.66±0.29ab3.2±0.17bQDHF-213.16±0.31c6.83±0.23ab1.91±0.20aQDHF-312.96±0.45c7.25±0.53ab1.78±0.24aQDHF-412.05±0.33b7.33±0.65b1.64±0.11aQDHF-510.12±0.20a6.42±0.35a1.57±0.34a

注：同一列不同字母上标代表数值间差异显著(P<0.05)。下同。

图2 不同菌株发酵液产蛋白酶活力的测定Fig.2 Determination of protease activity in fermentation broth of different strains注：图中不同小写字母代表差异显著(P<0.05)。下同。

2.2 QDHF-1菌株产酶发酵条件工艺优化

如表3所示，3个单因素中，对QDHF-1产酶发酵的影响顺序为时间>pH值>温度，因此最佳产酶发酵条件为pH 8，温度为30 ℃，发酵时间72 h。

表3 正交试验结果表Table 3 Results of the orthogonal experiment

2.3 QDHF-1菌株的鉴定结果

2.3.1 形态特征及生理生化鉴定

QDHF-1的菌落形态是乳白色、圆形、凸起、边缘整齐、湿润的光滑小菌落。对QDHF-1菌株进行革兰氏染色和芽孢染色，结果如图3所示，QDHF-1为革兰氏阳性、产芽孢的两端钝圆的杆状细菌。对QDHF-1菌株进行部分生理生化鉴定试验，结果如表4所示。查阅《伯杰细菌鉴定手册》和《细菌系统鉴定手册》，并未发现有对应生理特征的种属分类。因此，对QDHF-1菌株采用16S rRNA基因序列分析进行鉴定。

图3 菌株QDHF-1的革兰氏染色观察Fig.3 The image of QDHF-1 after gram stain

表4 生理生化鉴定Table 4 Physiological and biochemical experiments

试验名称试验结果试验名称试验结果酪素水解试验+硝酸盐还原试验+吲哚试验-葡萄糖利用试验+甲基红试验+果糖利用试验+V.P. 试验-甘露醇利用试验+硫化氢试验+5%(质量分数)NaCl+明胶液化试验-7%(质量分数)NaCl+淀粉水解试验+10%(质量分数)NaCl+接触酶试验-

注：表中“+”表示阳性反应，“-”表示阴性反应。

2.3.2 16S rDNA全序列分析

2.3.2.1 PCR扩增结果

经PCR扩增获得菌株16S rRNA基因片段的长度为1 500 bp左右，如图4所示，条带清晰，可用于菌株16S rRNA序列的测定。

图4 16S rRNA基因PCR扩增产物Fig.4 PCR amplification product of 16S rRNA gene

2.3.2.2 系统发育树分析

登陆www.NCBI.com网站，在GeneBank中通过Blast得到与QDHF-1菌株序列相似度较大的菌株，通过Clustul软件同GeneBank中的相似序列进行比对，可知QDHF-1与Thalassobacillussp. LY18同源性为99.3%。利用MEGA 5.0软件绘制出系统发育树，可以确定QDHF-1为Thalassobacillus属。将QDHF-1序列提交GeneBank获得登录号为KF357910(图5)。QDHF-1菌株属于Bacteria(细菌)，Firmicutes(厚壁菌门)，Bacilli(杆菌)，Bacillales(芽孢杆菌目)，Bacillaceae(芽孢杆菌科)，Thalassobacillus属，命名为Thalassobacillussp.QDHF-1。

图5 QDHF-1菌株16S rRNA同源性构建的系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree of strain QDHF-1 on 16S rRNA gene sequence

2.4 QDHF-1菌株对海参肠发酵产多肽的工艺优化

2.4.1 接种量对发酵产多肽含量的影响

接种量对QDHF-1发酵海参肠发酵液中多肽含量的影响结果如图6所示。随着接种量不断增加，发酵液中多肽含量呈先上升后下降的趋势。当接种量在2%～8%时，发酵液中多肽含量呈上升趋势，当接种量为6%和8%时，发酵液的多肽含量没有显著性差异(P<0.05)。因此选择接种量为6%较为合适，此时发酵液中多肽质量浓度为5.02 g/L。当接种量为10%时，多肽含量开始下降，可能是由于菌体数量过多，开始分解发酵液中的多肽所致。

图6 接种量对发酵液产多肽含量的影响Fig.6 Effect of inoculum size on the content of polypeptide in fermentation

2.4.2 发酵时间对发酵产多肽含量的影响

发酵时间对QDHF-1发酵海参肠发酵液中多肽含量的影响结果如图7所示。随着发酵时间的增加，发酵液中多肽含量呈先上升后下降的趋势。当发酵时间为36 h，多肽含量达到最大值为7.66 g/L，显著高于其他组(P<0.05)。随着发酵时间的延长，发酵液中多肽含量开始逐渐下降，可能是菌体开始消耗多肽所致。因此选择发酵时间为36 h较为合适。

图7 发酵时间对发酵液产多肽含量的影响Fig.7 Effect of fermentation time on polypeptide content in fermentation

2.4.3 料水比对发酵产多肽含量的影响

料水比对QDHF-1发酵海参肠发酵液中多肽含量的影响结果如图8所示。随着料水比的不断增加，肽含量呈先增加后下降的趋势。当料水比为1∶5(g∶mL)时，多肽质量浓度为13.21 g/L，显著高于其他组(P<0.05)。随着料水比的继续增加，肽含量不断减小，原因可能是料水比的增加造成了肽含量的稀释。因此选择料水比为1∶5(g∶mL)较为合适。

图8 料水比对发酵液产多肽含量的影响Fig.8 Effect of solid-liquid ratio on polypeptide content in fermentation

2.5 海参肠发酵物多肽的抗氧化活性

2.5.1 不同浓度海参肠发酵物多肽对羟自由基(·OH)的清除能力

不同浓度的海参肠发酵物多肽对羟自由基的清除作用结果，如图9所示。随着海参肠发酵物多肽质量浓度的增大，对羟自由基的清除率逐渐增大，质量浓度为50 g/L时，清除率为93.94%。因此，海参肠发酵物多肽对羟自由基具有良好的清除能力。

图9 海参肠发酵物多肽对·OH的清除作用Fig.9 ·OH scavenging effects of fermentation product polypeptide of sea cucumber

2.5.2 不同浓度海参肠发酵物多肽对二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)的清除能力

不同浓度的海参肠发酵物多肽对DPPH·的清除作用结果，如图10所示。随海参肠发酵物多肽质量浓度的增大，DPPH·自由基清除率呈不断增大的趋势。当海参肠发酵物多肽质量浓度为50 g/L时，清除率为32.38%。随着浓度继续增加，对DPPH·自由基清除率维持在一定水平。

图10 海参肠发酵物多肽对DPPH·的清除作用Fig.10 DPPH· scavenging effects of fermentation product polypeptide of sea cucumber

图11 海参肠发酵物多肽对的清除作用 scavenging effects of fermentationproduct polypeptide of sea cucumber

3 结论

本实验通过初筛和复筛从海参肠道中分离筛选获得1株产蛋白酶的菌株QDHF-1，确定菌株QDHF-1是芽孢杆菌目，命名为Thalassobacillussp.QDHF-1，其最佳产酶发酵条件为pH 8，温度30 ℃，发酵时间72 h。将菌株Thalassobacillussp.QDHF-1应用于发酵海参肠，其最佳工艺条件为接种量6%，料水比1∶5(g∶mL)，发酵时间36 h；海参肠发酵物多肽具有良好的抗氧化活性，其中对羟自由基的具有较强的清除能力，当海参多肽质量浓度为50 g/L时，对羟自由基清除率可达93.94%。本研究为开发具有抗氧化活性的海参肠解多肽产品提供实验依据。