重庆水豆豉发酵过程中NaCl、还原糖和氨基酸变化与滋味的形成

梁叶星，张玲*，高飞虎，张雪梅，李雪，张欢欢，杨世雄，熊家艳

1(重庆市农业科学院农产品贮藏加工研究所，重庆,401329) 2(重庆西南师范大学出版社有限公司，重庆,400716)

水豆豉，又名姜豆豉，以细菌为主制曲产生酶系分解黄豆中营养物质而制成，是川渝地区的传统发酵豆制品[1-2]，也是具有重庆本地特色的调味品。其营养全面、含有多种功能因子[3]，具有抗氧化[4-5]、抗肿瘤[6]、降血糖[7]、降血压[8-10]等多种生理功能，因此重庆水豆豉有良好的市场前景。

大豆发酵食品具有独特的滋味和风味，深受广大消费者的喜爱，消费需求量较大[7]。经过发酵，大豆发酵食品的质地口感、滋味发生了巨大变化，形成了大豆发酵食品独特的滋味。水豆豉是细菌型豆豉的代表，其参与发酵的主要微生物是枯草芽孢杆菌、乳酸菌、微球菌等[11]。因其独特的生产工艺、多样性菌群结构和添加辣椒、姜等调味料，使其成品具有与其他类型豆豉不同的特色滋味。

目前有对我国传统发酵豆制品滋味的相关研究报道，主要集中在豆腐乳、毛霉豆豉、曲霉豆豉等。研究表明，游离氨基酸和小肽段的构成决定了发酵食品的滋味[12-15]。索化夷等[16]对毛霉豆豉发酵过程中的滋味变化进行了研究，表明氨基酸、还原糖等共同决定了永川毛霉豆豉特有的咸鲜回甘的滋味特点。研究发现腐乳的鲜味除了来源于谷氨酸等游离氨基酸成分，还与小分子肽段的呈鲜作用有一定关系。由于重庆水豆豉通常是在自然条件下发酵而成，导致其产品质量不稳定，不同批次产品风味口感差异大等问题，限制了其产品的推广和发展。对自然接种重庆水豆豉发酵过程中滋味形成变化规律的研究，有利于评价其感官品质形成机制。目前，水豆豉滋味形成规律的相关研究还未见报道。

本研究对重庆水豆豉在自然发酵过程中各发酵时期氨基酸、还原糖、NaCl、总酸的变化进行了测定，通过分析总结其变化规律，为构建重庆水豆豉感官品质特征参数，制定水豆豉产品质量标准提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本实验所用材料是经重庆地区传统水豆豉生产工艺自然发酵，取自不同发酵阶段的重庆传统水豆豉。原料是重庆本地大豆。重庆传统水豆豉生产工艺如下：

大豆筛选→浸泡→沥干→常压蒸煮(煮豆水冷藏备用)→冷却→自然接种发酵(室温(20±2)℃)→拌料(煮豆水、食盐含量 12 g/100 g、姜粒、辣椒面、白酒)→入坛发酵后熟(室温(20±2)℃)→成品。

样本采集后，样品用滤纸吸干表面水再经冷冻干燥后研磨过20目筛，密封存放于-18 ℃冰箱中备用。S1～S12分别代表了不同发酵时期的重庆水豆豉样品。详见表1。

表1 实验样品的编号Table 1 Number of different experimental samples

茚三酮、磺基水杨酸、氨基酸分析仪缓冲液:赛卡姆(北京)科学仪器有限公司；3，5-二硝基水杨酸(3,5-dinitrosalicylic, DNS)，其他化学试剂均为分析纯:成都市科龙化工试剂厂。

1.2 仪器与设备

S-433D氨基酸分析仪，赛卡姆科学仪器有限公司；HH-4数显恒温水浴锅，国华电器有限公司；GL-12A高速冷冻离心机，上海菲恰尔分析仪器有限公司；UV-6000PC紫外可见光分光光度计，上海元析仪器有限公司；LyoQuest实验室冻干机，西班牙泰事达科技公司。其他试验仪器设备为实验室常用设备。

1.3 方法

1.3.1 还原糖、总糖含量测定

参照索化夷等方法测定[16]。

1.3.2 NaCl含量测定

参照GB/T 12457—2008 规定的间接沉淀滴定法测定[17]。

1.3.3 总酸含量测定

参照GB/T 12456—2008中的酸碱滴定法测定[18]。

1.3.4 总氨基酸和游离氨基酸测定

参照GB 5009.124—2016食品中氨基酸含量的测定[19]。

1.3.4.1 样品总氨基酸测定前处理

采用常规酸水解-厌氧管充氮密封水解法,略有改动。准确称取50 mg的样品于20 mL厌氧水解管中；向水解管中加入10 mL 6 mol/L HCl(含体积分数0.1%苯酚)，将样品全部浸没；将水解管放入冰块中冷冻10 min；充高纯氮气15～30 s，保持水解管竖直，不要将液面溅起，移开氮气后立即盖好软塞，旋紧密封盖；将水解管置于(110±1)℃恒温烘箱中水解22 h，水解完成后，冷却、混匀、过滤、滤渣清洗3次，合并溶液定容到50 mL；准确吸取1 mL水解液，于60 ℃浓缩至干以尽量排除其中的干扰；准确加入2 mL样品稀释液，振荡混匀，用0.22 μm针式过滤器过滤后供上机测定。

1.3.4.2 样品游离氨基酸测定前处理

称取1.00 g左右的样品于锥形瓶中，用50 mL、0.01 mol/L HCl浸提30 min；摇匀后过滤，准确吸取滤液2 mL于离心试管中，加入8%(体积分数)磺基水杨酸2 mL，混匀，静置15 min；10 000 r/min离心10 min；取上清液，过0.22 μm滤膜后上机测定。

1.3.4.3 分析条件

流动相经洗脱泵流过，流速0.45 mL/min；茚三酮经衍生泵流过，流速0.25 mL/min。分离柱柱温为38～74 ℃梯度升温；反应柱柱温130 ℃。

1.3.5 感官评价

感官评价在(25±1)℃的感官评价实验室中进行。由9名经过专业培训的27～45岁技术人员组成评定小组，统计总分，取平均值。使用各种滋味标准对所有小组成员进行训练，以便他们能够准确地描述滋味类型和强度。评定小组成员分别对不同发酵阶段的水豆豉产品进行感官评价，评分表如表2所示。

表2 滋味感官评分表Table 2 Sensory evaluation table of flavor

1.3.6 数据分析

数据以均数±标准差(x±sd)表示，采用SPSS 19.0统计软件进行线性回归分析，P<0.05表示差异有显著性，双变量相关采用Pearson线性相关。

2 结果与分析

2.1 水豆豉发酵过程中NaCl含量的变化规律

水豆豉中的咸味主要来源于NaCl，而NaCl又主要来自于水豆豉后发酵开始时添加的食盐。由图1可知，原料大豆中NaCl含量(质量分数)可以忽略不计，直到后发酵开始添加了食盐后，NaCl逐渐渗透到水豆豉内部，水豆豉中NaCl含量开始逐渐上升，在S9期以后，其质量分数含量快速上升到10%左右，此时水豆豉汤汁中的NaCl含量和水豆豉中的NaCl含量逐渐趋于平衡，NaCl渗入水豆豉的速度减缓，NaCl质量分数最后保持在10.12%，略低于研究报道的贵州水豆豉成品的11.76%[20]，但是已超过了SALLES等报道的Na+的呈味阈值[21]，水豆豉的NaCl含量总体上低于毛霉豆豉[16]和阳江豆豉[20]，这也说明了水豆豉的咸味适中。

图1 水豆豉发酵过程中NaCl含量的变化Fig.1 The sodium chloride content change during different fermentation stages of Shuidouchi

2.2 水豆豉发酵过程中总酸含量的变化规律

发酵过程中总酸含量高低直接影响水豆豉微生物生产和发酵进程，同时也影响水豆豉成品的滋味形成[22]。由图2可知，原料在浸泡和蒸煮过程后，酸度保持不变，到了前发酵时期(S4～S5)，酸度开始上升，这是由于大豆经过蒸煮之后，部分细菌得到了一定程度生长，分泌了大量的酶，导致产生酸性代谢物较多[23]。进入到后发酵阶段(S6以后)，由于拌料过程中添加了食盐、姜粒、辣椒面等，同时添加了煮豆水，部分有机酸溶出，导致后发酵开始总酸含量略有下降，进入后发酵第3天(S7)以后，由于此阶段乳酸菌等生长，有机酸大量增加，酸度陡然上升，之后酸度值趋于平缓，到后发酵第9天(S10)以后，由于高盐厌氧发酵产生的酸累积，酸度值又有一定程度上升[4]，直到后发酵末期趋于稳定，最终总酸含量达到了3.86 g/100 g，总酸含量比毛霉豆豉和曲霉豆豉的含量高[22]，水豆豉发酵过程中会产生大量的有机酸，最终形成了水豆豉温和爽快的酸味口感，这可能是由于形成了乳酸、磷酸等[23]。

图2 水豆豉发酵过程中总酸含量的变化Fig.2 The total acidity change during different fermentation stages of Shuidouchi

2.3 水豆豉发酵过程中总糖和还原糖含量的变化规律

还原糖是水豆豉中甜味的来源之一，在发酵过程中主要是由微生物分解总糖转化而来。由图3可知，在浸泡和蒸煮过程中大豆中总糖溶出了一部分，总糖质量分数由19.62%下降至15.07%。在前发酵阶段的最后1天(S5)，总糖含量大幅度下降，进入后发酵阶段(S6以后)，总糖含量缓慢下降最后变化趋于平缓，发酵成熟时总糖质量分数下降到7.26%。由图4可知，在前发酵初期阶段，由于微生物利用，还原糖消耗量较大，而总糖转化为还原糖的量较小，导致在S3期还原糖含量下降。S3期以后，还原糖质量分数上升较快，由1.16%上升到4.19%，在前发酵的最后1天(S5)，由于糖化酶活力增强，还原糖的消耗量略高于生成量，所以还原糖的含量开始下降，进入后发酵阶段(S6以后)，由于添加了煮豆水、盐、酒等，对微生物生长有一定影响，还原糖含量出现小幅度上升，S8期以后还原糖由于微生物的利用而逐渐下降，最后还原糖含量处于较低水平，由于水豆豉中还原糖含量较低，又没有如毛霉豆豉等在后发酵过程中添加外源糖分，所以水豆豉成品的甜味感觉较弱。

图3 水豆豉发酵过程中总糖含量的变化Fig.3 The total sugar content change during different fermentation stages of Shuidouchi

图4 水豆豉发酵过程中还原糖含量的变化Fig.4 The reducing sugar content change during different fermentation stages of Shuidouchi

2.4 水豆豉发酵过程中总氨基酸变化规律

由表3可知，原料黄豆浸泡和蒸煮过程对于水豆豉总氨基酸含量变化影响不大，在前发酵阶段(S4～S5)由于微生物分解产生了蛋白酶后水分的

散失，总氨基酸含量略有上升。当进入后发酵阶段(S6以后)，由于添加了煮豆水、盐、姜、辣椒粉等配料，导致其总氨基酸含量下降至28.598 g/100 g。在后发酵过程中总氨基酸含量略有下降，最终含量为22.540 g/100 g，这可能是由于酶作用转化的游离氨基酸溶于水豆豉汤汁之中。水豆豉成品中检测出了人体的必需氨基酸，色氨酸由于酸水解过程破坏而未能检测出含量。水豆豉总氨基酸含量中排名前5的氨基酸分别为谷氨酸(4.369 g/100 g)、亮氨酸(2.141 g/100 g)、天冬氨酸(1.914 g/100 g)、苯丙氨酸(1.492 g/100 g)、丙氨酸(1.406 g/100 g)。5种主要的氨基酸占水豆豉总氨基酸的50.23%。其主要氨基酸与永川毛霉豆豉的主要氨基酸有一定的区别[16]。

表3 水豆豉发酵过程中总氨基酸含量的变化 单位：g/100 g

注：ND表示酸水解过程中被破坏而未检出。下同。

2.5 水豆豉发酵过程中游离氨基酸含量的变化规律

游离氨基酸是呈味物质，对水豆豉滋味的形成有重要作用。由表4可知，游离氨基酸在发酵前期含量较低，经过酶系作用后，游离氨基酸在前发酵末期(S5)大幅度的增加，进入到后发酵阶段(S6以后)，游离氨基酸含量继续增大，由原料中的3.471 mg/g上升到后发酵末期的峰值42.495 mg/g，增加了11.25倍；但后发酵结束时，游离氨基酸含量有一定幅度的回落，主要原因可能是后发酵结束，一方面部分游离氨基酸溶出到水豆豉汤汁中，另一方面游离氨基酸参与了发酵后期的美拉德反应，导致其含量下降[24]。陈清婵研究也发现霉菌纯种制曲豆豉游离氨基酸含量普遍呈现快速增加，之后有所下降的现象[24]。发酵结束时的水豆豉其游离氨基酸按含量的高低排名前5的为Phe、Leu、Glu、Ala、Val，占水豆豉游离氨基酸总量的55.47%。这与索化夷报道的永川毛霉豆豉的氨基酸特征谱基本一致，区别在于永川毛霉豆豉特征谱中有半胱氨酸，而水豆豉则有丙氨酸[16]。

表4 水豆豉发酵过程中游离氨基酸含量的变化 单位：mg/g

2.6 水豆豉发酵过程中感官评价与有关成分的相关性分析

由表5可知，水豆豉在浸泡(S2)和蒸煮(S3)过程中，对整体的滋味影响不明显，滋味都处于极弱的水平。前发酵阶段(S4)，逐渐产生了鲜味、甜味、酸味等味感，但味感较弱；至前发酵结束，鲜味和酸味出现了明显的增强，甜味变化不明显。后发酵阶段(S6)开始，由于食盐的添加，食盐逐渐渗入水豆豉使其咸味增强。后发酵阶段，由于微生物和酶系作用，产生了大量游离氨基酸和有机酸[16]，水豆豉鲜味和酸味明显增强，苦味和甜味的变化不明显。对水豆豉发酵过程中的NaCl含量、总酸含量、总糖含量、还原糖含量、氨基酸含量与滋味感官评分进行相关性分析，结果如

表6所示，水豆豉咸味与NaCl含量呈极显著正相关(P<0.01)，说明后发酵添加食盐是水豆豉咸味的主要来源。鲜味与游离氨基酸呈极显著正相关(P<0.01)，表明发酵产生的鲜味游离氨基酸与水豆豉鲜味的形成有关。酸味与总酸含量呈极显著正相关(P<0.01)，说明水豆豉酸味的形成与发酵过程产酸有关。甜味与还原糖含量相关性不显著，甜味与游离氨基酸含量呈极显著正相关(P<0.01)，甜味与总糖含量呈极显著负相关(P<0.01)，表明水豆豉甜味与发酵产生的还原糖关联度较小，与甜味氨基酸的形成有一定的联系，这可能是由于水豆豉中还原糖含量较低，其他滋味对于甜味呈味有负面影响，导致感官品评的甜味较弱。

表5 水豆豉发酵过程中感官评分 单位：分

注:a～g不同字母表示各组数据差异具有显著性(P<0.05)。

表6 水豆豉发酵过程中各参数的相关性矩阵表Table 6 Correlation of parameters during different fermentation stages of Shuidouchi

注：**表示在0.01水平上呈极显著性相关，*表示0.05水平上呈显著性相关。

3 讨论与结论

水豆豉具有与其他干豆豉不同的特色风味，一方面是由于在后发酵过程中加入了姜粒和辣椒面，这赋予了水豆豉独特的辛辣滋味，另一方面就是水豆豉在发酵过程中由于微生物作用，导致NaCl、总酸发生变化，对成品咸味、酸味有重要的影响。蛋白质水解形成游离氨基酸与其味感有一定的关联，尤其是发酵豆制品中的鲜味和苦味物质主要是由于蛋白质水解产生，不同口味的物质在一起，会发生味道的相消、相乘等作用[25-26]，最终共同形成了水豆豉独特的滋味，其中游离氨基酸的变化对于水豆豉口味形成的作用尤其重要。

研究发现，氨基酸的滋味可以分为鲜味(天冬氨酸、谷氨酸)、甜味(甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸、丙氨酸)、甜苦味(赖氨酸、脯氨酸)、苦味(缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸)和无味(半胱氨酸)等5大类[27-29]。水豆豉游离氨基酸排名前5的主要氨基酸为Phe、Leu、Glu、Ala和Val。廖顺[30]在白腐乳的研究中发现其中肽Asp-Phe-Lys-Arg-Glu-Pro呈现鲜味，肽Asp-Glu-Asp-Phe-Lys-Arg-Glu-Pro呈现鲜味和酸味。索化夷[16]在对永川毛霉豆豉的研究中发现其呈味氨基酸谱带为Glu+Leu+Cys+Phe+Val。HAN[26]发现青腐乳中，Ala、Ile、Val和Phe为主要氨基酸。不同类型的大豆发酵制品其氨基酸组成差异较大，主要可能与发酵的菌群不同导致蛋白质水解程度不一致有关[31]。

水豆豉游离氨基酸中，鲜味氨基酸占比 13.45%，甜味氨基酸占比22.25%，苦味氨基酸占比59.31%。这与干豆豉的比例相比，鲜味氨基酸占比较低，而苦味氨基酸占比较高[20,32]。谢靓等[33]用电子舌检测出不同发酵阶段豆豉滋味变化，其味觉差异主要体现在苦味、鲜味和咸味上，且苦味回味差别较小，这与我们日常食用豆豉的口感接近。水豆豉食用的口感主要是咸鲜味，略带酸味，略微有一点苦味和涩味。咸味主要与食盐添加后的NaCl有关，发酵结束时水豆豉中NaCl质量分数高达10.12%，远远高出了咸味的感官阈值1 300 mg/L[21]，所以其咸味的滋味明显。鲜味主要来源于蛋白质分解产生的氨基酸和短肽，鲜味呈味氨基酸主要是谷氨酸和天冬氨酸，其含量分别达到了3.69、0.931 mg/g，含量虽然不高，但是也能明显感受到鲜味滋味。水豆豉中酸味是其特征风味之一，发酵结束时其总酸含量高达3.86 g/100 g，使得水豆豉回味中有一定酸的滋味。另外，水豆豉中还略微有一点苦味，可能是苦味氨基酸和酚类物质产生的[16]，但由于咸鲜味感较强而被掩盖，导致食用时仅能感受到一点后苦味。

综上所述，水豆豉自然发酵过程中，其滋味主要是在后发酵阶段形成。其NaCl在后发酵阶段开始呈现逐渐上升后趋于稳定的趋势；酸度进入后发酵第3天，含量陡然上升，之后酸度值趋于平缓，直到后发酵末期趋于稳定；还原糖含量呈现先上升后下降的趋势；总氨基酸含量下降，游离氨基酸含量增加了11.25倍。水豆豉发酵完成后按含量递减顺序确定的前5个主要特征氨基酸为Phe、Leu、Glu、Ala、Val，占水豆豉游离氨基酸总量的55.47%。水豆豉中NaCl、还原糖、总酸、呈味氨基酸与后发酵阶段添加的辣椒、姜等混合最终形成了重庆水豆豉独特的鲜咸酸辣略有回甜的滋味。