骨碎补对牙周炎大鼠正畸牙移动保持阶段RANKL表达影响的研究

宋佳 赵刚 宋春蕾

摘要：目的  研究牙周炎的大鼠牙齒移动保持阶段，中药骨碎补对牙槽骨成骨作用以及对RANKL表达影响的研究。方法  将45只雄性Wister大鼠建立牙周炎实验模型。按照随机数字表法将大鼠分成9个组，每组5只，进行标记。其中1组设为空白组，4组对照组，4组实验组。空白组拉簧牵拉上颌左侧第一磨牙向近中移动，牵拉21 d后分别在保持3，7，14，21 d处死;实验组和对照组分别建立牙移动模型，实验组在保持阶段的3，7，14，21 d的前1天灌服骨碎补水煎液0.9 g/kg， 1次/d;对照组同样时间灌服等量0.9%氯化钠溶液，1次/d。HE染色观察成骨细胞和破骨细胞。免疫组织化学切片观察RANKL因子表达量。结果  实验组的RANKL表达量在初期先增加，从第7 d开始RANKL表达量开始逐渐降低。同一节点对比，实验组RANKL表达量低于对照组。实验组在保持第21 d RANKL表达量非常少，牙周膜处于稳定状态，差异有统计学意义（P<0.05）。结论  骨碎补水煎液可以促进成骨，稳定牙槽骨及牙周膜的改建，降低RANKL的表达。

关键词：骨碎补;牙周炎;牙移动;RANKL

中图分类号：R781.4                                   文献标识码：A                               DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.04.028

文章编号：1006-1959（2019）04-0085-03

Abstract：Objective  To study the effect of Chinese medicine granules on the alveolar bone osteogenesis and the expression of RANKL in periodontitis rats. Methods  45 male Wister rats were established experimental models of periodontitis. Rats were divided into 9 groups according to the random number table method， and 5 rats in each group were labeled. One group was set as blank group， 4 groups were control group， and 4 groups were experimental group. The blank group was pulled to pull the first molar on the left side of the upper jaw and moved to the middle. After 21 d of pulling， the rats were sacrificed for 3， 7， 14 and 21 d.The tooth movement model was established in the experimental group and the control group respectively.The experimental group was given 0.9 g/kg of decoction of bone decoction once a day， 3， 7， 14， 21 d of the maintenance phase， once a day;The control group was given the same amount of 0.9% sodium chloride solution once a day for the same time. Osteoblasts were observed by HE staining. Immunohistochemical sections were used to observe the expression level of RANKL factor. Results  The expression level of RANKL in the experimental group increased first， and the expression level of RANKL began to decrease gradually from the 7th day. Compared with the same node， the expression level of RANKL in the experimental group was lower than that in the control group. In the experimental group， the expression of RANKL was very low at 21 d and the periodontal ligament was stable，the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion  Wound decoction can promote osteogenesis， stabilize the alveolar bone and periodontal ligament， and reduce the expression of RANKL.

Key words：Orthodontic;Periodontitis;Tooth movement;RANKL

口腔正畸治疗牙周病可以减轻患牙松动度、改善病患的出血情况，降低病患牙周袋深度[1]。但是正畸牙移动后，牙周膜纤维组织改建较慢并有恢复趋势，很容易使牙齿发生移动。目前对牙周病正畸治疗后保持阶段研究较少。中药骨碎补具有强骨、止痛的功效。现已被制成多种制剂用于牙齿松动、跌扑闪挫、筋骨折伤[2]。转录因子NF-KB受体活化剂配体（receptor activator of NF-kB ligand，RANKL）是参与骨改建的重要细胞因子之一。成骨細胞和基质细胞均表达RANKL和OPG，都能与破骨细胞表面的RANK结合，RANKL与破骨细胞细胞膜上的RANK结合，促进破骨细胞的分化成熟，并且抑制破骨细胞的凋亡[3]。本研究通过给患有牙周炎正畸牙移动保持阶段的大鼠灌服水煎骨碎补中药，用免疫组化检测RANKL因子的表达，探讨中药骨碎补在牙周炎正畸牙移动后保持阶段对牙周膜及牙槽骨的改建作用，为缩短牙周炎正畸患者保持时间提供实验依据。

1材料与方法

1.1材料  每2000 ml 水中加 20 g 骨碎补（购于黑龙江省佳木斯中医院）浸泡 30 min，加热至沸腾半个小时后滤渣，将滤液浓缩至 200 ml，即制成 100% 浓度的水煎剂。

1.2实验动物  选择清洁级Wistar大鼠，雄性，体重（180～220 g）45只[购于佳木斯大学动物实验中心，许可证号SCXK（黑）2013-001]，按照《实验动物保护条例》饲养，消毒，清理，喂养无菌饲料（由佳木斯动物实验中心提供），饲养1周后开始动物实验。

1.3方法

1.3.1分组  按照随机数字表法将大鼠分成9个组，每组5只，进行标记。其中1组设为空白组，4组对照组，4组实验组。牙周炎组建立牙周炎模型，注射过量10%的水合氯醛处死，HE染色及免疫组化染色。实验组和对照组建立牙周炎及正畸牙移动模型，实验组灌服骨碎补水煎液，对照组灌服等量的0.9%氯化钠溶液。分别在第3，7，14，21 d处死，HE染色及免疫组化染色。

1.3.2实验动物模型建立  牙周炎动物模型建立：用10%水合氯醛3.5 ml/kg（100 ml，雷根生物供应室，实验使用），腹腔麻醉，仰卧位固定，上开口器（用0.9 mm不锈钢弯制），用探针（口腔器械盒，保定市医疗器械有限公司）将大鼠上颌左侧第一磨牙牙龈剥离。在大鼠上颌左侧第一磨牙近中牙颈部龈沟处用快速手机（402高速手机，顺逊医疗器械）磨0.2 mm深固位沟，选用0.20 mm结扎丝（杭州奥索医疗器械有限公司）将大鼠上颌左侧第一磨牙结扎（尽量结扎到牙龈沟处）。给大鼠喂养高糖水（100 g/L），将饲料（佳木斯大学动物实验中心提供）泡软，为期1个月。1个月观察可见上颌第一磨牙牙龈红肿、探诊出血、牙周袋，即牙周炎动物模型建立成功。

正畸牙移动模型建立：将大鼠麻醉，固定，大鼠上颌两颗中切牙颈部的远中面磨出深0.2 mm的固位沟，拉簧（镍钛合金牙齿矫形拉簧，北京圣玛科技有限公司）一侧连接大鼠磨牙，另一侧与大鼠切牙连接。测力计（杭州奥索牙用测力计杆式测力计，50/格）测拉力约50 g，加力21 d。建立保持期模型，用结扎丝连扎大鼠第一磨牙及切牙，保持第一磨牙移动后位置。在加力装置去除前1 d开始灌服。实验组灌服骨碎补水煎液（中医院购买，制备成0.9 g/kg溶液），对照组灌服等量的0.9%氯化钠溶液。分别在3，7，14，21 d处死大鼠。

1.3.3免疫组化及HE染色  取大鼠左侧上颌骨，在4%多聚甲醛固定液（北京华越洋生物科技有限公司）固定24 h。在EDTA溶液中4℃脱钙50 d。PBS冲洗干净、石蜡包埋，与牙体长轴平行切片，取牙齿近远中组织切片免疫组化。①HE染色：烤片，二甲苯脱蜡25 min，苏木素侵泡3 min染色，淡氨水反蓝，冲洗，0.5%伊红侵泡2 min，冲洗，梯度乙醇脱水，中性树胶封片。②免疫组化染色：烤片，二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化，室温下使用复合酶消化液，滴加抗原修复液I，充分暴露抗原，用3%过氧化氢孵育以阻断内源性过氧化物酶活性，滴加二抗，DAB溶液显色，电镜下观察抗原抗体，梯度乙醇脱水，中性树胶封片。

1.4评价标准  RANKL表达量用平均光密度值，每个组织切片随机分析片子上、中、下三个不同部位的高倍镜视野，测量其平均值，测量值越大，RANKL表达越多。观察免疫组化切片可见，RANKL的阳性表达集中在大鼠牙槽骨骨髓基质细胞中，胞膜、胞质及核膜都被染色，呈棕黄色颗粒状[4]。

1.5统计学分析  使用GraphPad prism 5.0软件对数据统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验;计数资料以（%）表示，采用χ2检验。采取多因素方差方法分析比较时间和药物因素对RANKL表达的影响，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色结果  动物实验模型初期，可见牙周膜纤维界限模糊不清，牙周纤维拉长。在第3天时可见破骨细胞以及成骨细胞团，牙根处牙周膜内可见成骨细胞（图1A、1B），实验组牙周纤维排列规律，而对照组牙周纤维紊乱，但差异不明显。在第7天开始到第21天，牙周膜宽度逐渐缩小，纤维排列稳定，出现大量的成骨样细胞。对照组牙周纤维比较紊乱，存在成骨细胞的同时也存在大量的破骨样细胞。在保持的第21天，实验组可见细胞大部分处于稳定的状态且看到成骨细胞（图1D），对照组牙周膜细胞排列紊乱（图1C）。

2.2免疫组织化学染色结果  RANKL因子主要表达在牙周膜及牙槽骨的细胞膜及细胞浆等部位，阳性的表达结果变现为黄色或黄棕色，淡蓝色为阴性表达，白色是底色。在保持开始到第7 d，可见RANKL因子大量表达（图2E、F）。随着保持时间延长，可见RANKL因子表达量逐渐降低，并且出现阴性表达。在保持第21 d对照组可见吸收陷窝（图G），第21 d实验组RANKL因子表达量微乎其微并出现大部分淡蓝色阴性表达，差异有统计学意义（P<0.05），见表1、图H。

3讨论

牙周炎是牙龈炎未得到及时治疗，导致炎症由牙龈向深层扩散到牙周膜、牙槽骨和牙骨质而发展引起的牙周组织的慢性炎症，严重时牙齿将不能保留[5]。近年来有学者[6]将正畸治疗导入牙周病的综合治疗系列，即在牙周炎症控制的基础上，通过完善的正畸治疗排齐牙列，恢复正常邻接关系，咀嚼功能。因此从正畸学角度来说，需要考虑牙周炎患者正畸治疗结束后的保持。目前，物理方法保持有：Hawley保持器、压膜式透明保持器、固定式舌侧保持器是临床中3种常用[7]。有研究应用一些强筋壮骨的中药可以促进成骨，促进正畸牙移动后的稳定，如仙灵骨葆可以抑制成年大鼠牙移动保持阶段破骨细胞生成，促进成骨细胞的生成[8]。

中药骨碎补的主要成分为：木栓，β-香树脂醇，β-谷甾醇等[9]。研究表明，骨碎补及有效成分通过提高BMP-2 蛋白和抑制 RANKL 的表达实现促进成骨细胞增殖分化和抑制破骨细胞活性的作用[10]。此外骨碎补有骨细胞保护作用、抗骨质酥松作用等[11]。陈莉丽等[12]发现在豚鼠牙齿畸形模型中，骨碎补能显著改善齿骨密度，使牙齿坚硬度增强，促进牙骨细胞的进一步合成。许彦枝等[13]研究发现骨碎补作用的人牙龈成纤维细胞生长分泌功能活跃、矿化能力增强。RANKL可促进破骨细胞的分化，增强成熟破骨细胞的活力，阻止破骨细胞凋亡，是破骨细胞分化成熟和维持功能所需的重要因子[14]。当RANKL表达量增加，破骨细胞分化激活成熟，牙周膜改建中。当RANKL表达量降低，破骨细胞分化受到抑制，停止骨吸收。

本研究中在保持阶段初期，牙周膜不稳定，RANKL表达量出现增加现象。随着保持时间的延长，牙周膜开始稳定于新的位置，RANKL表达量逐渐降低。灌服中药骨碎补水煎液的实验组RANKL因子降低快且大。在保持阶段第21 d，实验组RANKL表达量降低接近于空白组，但比空白组RANKL表达量略高。说明中药骨碎补对RANKL表达有抑制作用，促进骨改建成骨，促进牙周膜稳定。

综上所述，中药骨碎补对牙周膜改建有促进作用，抑制破骨RANKL因子的表达。若中药骨碎补应用于临床可减少牙周炎患者物理保持的时间，从而达到更好的治疗效果，及提高稳定性。

参考文献：

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[13]许彦枝，高永博，郭晶洁，等.骨碎补对体外培养人牙髓细胞增殖及超微结构的影响[J].中国医院药学杂志，2007，27（10）：1377-1380.

[14]黎彦龙，何明，陈秉雄，等.OPG-RANKL-RANK信号系统是调节破骨细胞及骨质疏松症的重要途径[J].中国组织工程研究，2015，19（24）：3894-3898.

收稿日期：2018-10-30;修回日期：2018-11-20

编辑/肖婷婷